Μηχανισμοί πλαστικότητας στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο: ο ρόλος της ελεύθερης ρίζας του μονοξειδίου του αζώτου και των α2 νοραδρενεργικών υποδοχέων

Abstract

Ontogenesis of the central nervous system includes processes such as cell-birth, migration, cell-fate determination, synapse formation and elimination. Similar plastic processes, i.e. synaptogenesis and neural circuit modification, occur following nervous system injury or during learning. Neurotransmitters, such as nitric oxide free radical (ΝΟ.) and noradrenaline, participate in nervous system normal development as well as in its reactions to environmental factors. ΝΟ. is a recently identified, non-typical neurotransmitter: it is a small molecule, very reactive, with a low half-life, readily diffusible in aqueous media and through lipid bilayers. It exerts its actions, mainly interacting with guanylyl cyclase. In contrast, noradrenaline is a well conserved neurotransmitter. Its action is mediated by membrane receptors coupled to G-proteins. Different types of noradrenaline receptorshave been characterized (α1, α2, β1, β2, β3), with α2 receptors localized presynaptically, post-synaptically and exo-synaptically. We investigated the role of ΝΟ. and α2 noradrenergic receptors in avian (quail and chicken) brain, during normal development, following injury and in learning andmemory. The activity of ΝΟ. biosynthetic enzyme (NOS) has been determined by the histochemical method of NADPH-diaphorase. Cell-birth has been studied by the immuno-cytochemical method of bromo-deoxy-uridine. The distribution of α2 noradrenergic receptors has been determined by in vitro quantitative autoradiographic binding of radio-labeled ligand. In quail cerebellum transient NOS expression was observed in Purkinje cells, which is correlated with the selective elimination of supernumerary afferent projections. Granule cells showed gradually increasing NOS activity, which they retain in adult life, possibly due to their participation in neural circuits storing kinetic memory. In the external granular layer, NOS positive (NOS+) fibers were found during the developmental stages when cell proliferation rate was high. This localization probably enables ΝΟ. to participate in the control of cell-divisions or cellmigration. Cells were still born in the external granular layer after hatching. Density of α2 noradrenergic receptors was very low in quail embryonic cerebellum. Optic tectum layers showed differential NOS activity during embryonic life. Positive cells were present in stratum griseum periventriculare from embryonic day 6 (E6) until mature stages. Bipolar cells in layer i, which synapse with the optic fibers, showed transient NOS activity, with a peak during the period synapses are formed and eliminated. During similar developmental stages, transient NOS activity was observed in other visual nuclei in brain stem (isthmic nuclei) and thalamus (nucleusdorsolateralis anterior thalami). Throughout the embryonic period studied, higher levels of α2 noradrenergic receptors were found in the outer layers of optic tectum (SGFSs) than in the deeper ones (SGFSd, SGC, SAC, SGP). Moreover, in all stages studied, a topographic gradient in α2 noradrenergic receptor density was observed (both rostro-caudally and dorso-ventrally). Significantly higher levels of α2 receptors were found at E16. Their topographic distribution and developmental profile suggests a role in synapse formation. Levels of α2 noradrenergic receptors were very low in other visual areas of quail brain during embryonic life. Suprachiasmatic nucleus was an exception as it showed high α2 noradrenergic receptor density from E12. Two types of NOS positive cells were found in chicken forebrain: with intense staining and apparent processes (type I) and smaller, granule cells, with light staining and no-obvious processes (type II). Type I cells attained their mature distribution pattern around hatching, with higher numbers in basal ganglia and neostriatum where ΝΟ. is probably involved in dopaminergic neurotransmition. During embryonic development, transient NOS expression was found in type II cells in nucleus basalis,ectostriatum, hyperstriatum ventrale, archeostriatum and parts of neostriatum, where ΝΟ. participates possibly in synapse formation and/or elimination. The localization of α2 noradrenergic receptors in quail forebrain exhibited topographic and developmental differences. Higher levels were present in the hippocampus, septum, nucleus basalis, basal ganglia and parts of neostriatum. The density of α2 noradrenergic receptors increased during development, with the exception ofhippocampus where it gradually decreased. Unilateral lesion of the right optic tectum at E9 did not affect the distribution of NOS+ cells in quail brain. On the contrary, α2 noradrenergic receptor density was modified. Three days after the lesion, transient changes were present in localized optictectum sectors as well as in the ectostriatum and area parahippocampalis; five days after the lesion, a large number of other brain areas was affected, which mainly belong to the limbic system. Unilateral transection of the left optic nerve in chicken hatchlings (N1) altered α2 noradrenergic receptor levels in specific parts of the optic tectum as well as in many other brain areas, mainly of the limbic system. Unilateral lesion of the right caudal-dorsal forebrain at E14 did not affect NOS activity in quail brain. Conversely, the expression of α2 noradrenergic receptors was modified in areas spanning the entire brain, including parts of the limbic system. In the intermediate part of hyperstriatum ventrale, α2 noradrenergic receptors participate in memory storage of aversive stimuli. Their number increased following the memory task (one-trial passive avoidance training) while their deactivation by an antagonist (rauwolscine) caused amnesia. In summary, ΝΟ. and α2 noradrenergic receptors take part in plastic processes during normal development (synaptogenesis, maturation of neural connections). ΝΟ. is probably part of the mechanism that controls cell cycle and/or cell-migration. α2 noradrenergic receptors participate in nervous system re-organization following injury as well as during learning and memory.

Η οντογένεση του νευρικού συστήματος περιλαμβάνει φαινόμενα όπως η γέννηση κι η μετανάστευση κυττάρων, ο κυτταρικός καθορισμός, ο σχηματισμός κι η απαλοιφή συνάψεων. Παρόμοια πλαστικά φαινόμενα, π.χ. συναπτογένεση και αναμόρφωση νευρικών κυκλωμάτων, παρατηρούνται έπειτα από τραυματισμό του νευρικού συστήματος και κατά τη διαδικασία μάθησης. Νευροδιαβιβαστές όπως η ελεύθερη ρίζα του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ.) και η νοραδρεναλίνη συμμετέχουν στη φυσιολογική ανάπτυξη του νευρικού συστήματος αλλά και στην απόκρισή του σε επιγενετικούς παράγοντες. Η ΝΟ. είναι μη τυπικός νευροδιαβιαβιβαστής: είναι ένα μικρό μόριο, ιδιαίτερα δραστικό και με μικρό χρόνο ημιζωής. διαχέεται ελεύθερα σε υδατικά διαλύματα και διαμέσου λιπιδικών διπλοστιβάδων και ασκεί τη δράση του κυρίως μέσω της γουανυλικής κυκλάσης. Η νοραδρεναλίνη είναι ένας νευροδιαβιβαστής, καλά συντηρημένος εξελικτικά. Ασκεί τη δράση του μέσω μεμβρανικών υποδοχέων συνδεδεμένων με G-πρωτεϊνες. Οι υποδοχείς της διακρίνονται σε τύπους:α1, α2, β1, β2, β3. Οι α2 νοραδρενεργικοί υποδοχείς εντοπίζονται προσυναπτικά, μετασυναπτικά και εξωσυναπτικά. Διερευνήθηκε η συμμετοχή των συστημάτων της ΝΟ. και των α2 νοραδρενεργικών υποδοχέων σε μηχανισμούς πλαστικότητας στον εγκέφαλο πτηνών κατά τη φυσιολογική ανάπτυξη, μετά από τραυματισμό και σε φαινόμενα μάθησης-μνήμης. Ως πειραματόζωα χρησιμοποιήθηκαν έμβρυα και νεοσσοί ορτυκιού και όρνιθας. Η ενεργότητα του βιοσυνθετικού ενζύμου της ΝΟ. (ΝΟΣ) καθορίστηκε με την ιστοχημική μέθοδο της NADPH-διαφοράσης. Η γέννηση κυττάρων εντοπίστηκε με την ανοσοϊστοχημική μέθοδο της βρωμο-δεοξυ-ουριδίνης. Η κατανομή των α2 νοραδρενεργικών υποδοχέων προσδιορίστηκε με εφαρμογή της in vitro ποσοτικής αυτοραδιογραφικής μεθόδου πρόσδεσης ραδιοσημασμένου δεσμευτή. Στην παρεγκεφαλίδα ορτυκιού παρατηρείται παροδική έκφραση ΝΟΣ στα κύτταρα Purkinje, που σχετίζεται με την επιλεκτική απαλοιφή υπεράριθμων προβολών από προσαγωγούς ίνες. Τα κοκκοειδή κύτταρα εμφανίζουν προοδευτικά υψηλότερη ενεργότητα ΝΟΣ, την οποία διατηρούν και σε ώριμα στάδια, ίσως λόγω της συμμετοχής τους στα κυκλώματα που αποθηκεύουν κινητική μνήμη. Στην εξωτερική κοκκώδη στιβάδα υπάρχουν ίνες με ενεργότητα ΝΟΣ στα αναπτυξιακά στάδια που ο ρυθμός των κυτταρικών διαιρέσεων είναι μεγάλος, πιθανά λόγω της συμμετοχής της ΝΟ. στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου ή της μετανάστευσης των νέων κυττάρων. Κυτταρικές διαιρέσεις στην εξωτερική κοκκώδη στιβάδα παρατηρούνται και μετά τη γέννηση των ζώων. Αντίθετα με τη σημαντική παρουσία της ΝΟ., τα επίπεδα των α2 νοραδρενεργικών υποδοχέων είναι πολύ χαμηλά στην εμβρυϊκή παρεγκεφαλίδα ορτυκιού. Στην οπτική καλύπτρα, η ενεργότητα ΝΟΣ παρουσιάζει διαφορές μεταξύ των στιβάδων της κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Στην παρακοιλιακή φαιά στιβάδα θετικά κύτταρα είναι παρόντα από την 6η εμβρυϊκή ημέρα (Ε6) ως και ώριμα στάδια. Τα δίπολα κύτταρα της υποστιβάδας i της οπτικής καλύπτρας, που συνάπτονται με τις ίνες του οπτικού νεύρου, παρουσιάζουν παροδικά ενεργότητα ΝΟΣ, με μέγιστο την περίοδο σχηματισμού και απαλοιφής συνάψεων με τις οπτικές ίνες. Σε αντίστοιχα αναπτυξιακά στάδια, παρατηρείται παροδική ενεργότητα ΝΟΣ και σε άλλα οπτικά κέντρα του στελέχους (ισθμικοί πυρήνες) και του θαλάμου (πρόσθιος έξω ραχιαίος πυρήνας). Καθόλη την εμβρυϊκή περίοδο που μελετήθηκε, η συγκέντρωση των α2 νοραδρενεργικών υποδοχέων είναι υψηλότερη στις επιφανειακές υποστιβάδες της οπτικής καλύπτρας (SGFSs) από ότι στις εν τω βάθει (SGFSd, SGC, SAC, SGP). Επίσης, σε όλη την ανάπτυξη παρατηρούνται τοπογραφικές διαφορές (κατά τον προσθοπίσθιο και το ραχιαίο-κοιλιακό άξονα) στα επίπεδα των α2 υποδοχέων. Συνολικά, η συγκέντρωση των α2 υποδοχέων αυξάνει σημαντικά την Ε16, γεγονός που σχετίζεται πιθανά με τη συμμετοχή τους στη ρύθμιση της συναπτογένεσης. Στις άλλες οπτικές περιοχές του εγκεφάλου ορτυκιού τα επίπεδα των α2 νοραδρενεργικών υποδοχέων είναι χαμηλά κατά την εμβρυϊκή ζωή. Εξαίρεση αποτελεί ο υπερχιασματικός πυρήνας όπου η συγκέντρωση των α2 υποδοχέων είναι ιδιαίτερα αυξημένη από την Ε12. Στον τελεγκέφαλο όρνιθας, διακρίνονται 2 τύποι ΝΟΣ θετικών κυττάρων: με έντονη χρώση και ορατές αποφυάδες (τύπου Ι) και μικρότερα, κοκκοειδή, με αχνή χρώση, χωρίς εμφανείς αποφυάδες (τύπου ΙΙ). Η κατανομή τους παρουσιάζει τοπογραφικές και αναπτυξιακές διαφορές. Η κατανομή των θετικών κυττάρων τύπου Ι αποκτά το ώριμο πρότυπο την περίοδο γύρω από την εκκόλαψη με υψηλότερο αριθμό τους στα βασικά γάγγλια και το νεοραβδωτό, όπου η ΝΟ. πιθανά σχετίζεται με τον έλεγχο της ντοπαμινεργικής νευροδιαβίβασης. Παροδική έκφραση ΝΟΣ σε κύτταρα τύπου ΙΙ παρατηρείται κατά την εμβρυϊκή ζωή στο βασικό πυρήνα, το εξωραβδωτό, το κοιλιακό υπερ-ραβδωτό, το αρχαιοραβδωτό και τμήματα του νεοραβδωτού, όπου η ΝΟ. πιθανά συμμετέχει στο σχηματισμό ή/και την απαλοιφή συνάψεων. Η κατανομή των α2 νοραδρενεργικών υποδοχέων στον τελεγκέφαλο ορτυκιού παρουσιάζει τοπογραφική και αναπτυξιακή ετερογένεια. Υψηλότερα επίπεδα απαντούν στον ιππόκαμπο, το διάφραγμα, το βασικό πυρήνα, τα βασικά γάγγλια και τμήματα του νεοραβδωτού. Η πυκνότητα των α2 υποδοχέων αυξάνεται γενικά κατά την ανάπτυξη, με εξαίρεση τον ιππόκαμπο όπου παρατηρείται σταδιακή μείωση. Η πειραματική καταστροφή της δεξιάς οπτικής καλύπτρας την Ε9 δεν επηρεάζει την κατανομή κυττάρων με ενεργότητα ΝΟΣ στον εγκέφαλο ορτυκιού. Αντίθετα, η πυκνότητα των α2 νοραδρενεργικών υποδοχέων τροποποιείται: τρείς ημέρες μετά από την καταστροφή της οπτικής καλύπτρας, παρατηρούνται παροδικές μεταβολές στα επίπεδα τους σε καθορισμένα τοπογραφικά τμήματα των στιβάδων της οπτικής καλύπτρας, καθώς και στο εξωραβδωτό και την παραϊπποκάμπια χώρα. πέντε ημέρες μετά την καταστροφή, επηρεάζονται διαφορετικές αλλά πολύ περισσότερες εγκεφαλικές περιοχές που ανήκουν κυρίως στο μεταιχμιακό σύστημα. Ετερόπλευρη διατομή του αριστερού οπτικού νεύρου σε νεοσσούς όρνιθας μίας ημέρας μετά την εκκόλαψη προκαλεί αλλαγές στα επίπεδα των α2 νοραδρενεργικών υποδοχέων σε συγκεκριμένα τμήματα της οπτικής καλύπτρας και σε πολλές εγκεφαλικές περιοχές, κυρίως του μεταιχμιακού συστήματος. Ετερόπλευρη καταστροφή του δεξιού οπίσθιου-ραχιαίου τελεγκεφάλου σε ορτύκια την Ε14, δεν μεταβάλλει την ενεργότητα της ΝΟΣ στον εγκέφαλο. Αντίθετα, τροποποιεί την έκφραση των α2 υποδοχέων σε περιοχές σε όλη την έκταση του εγκεφάλου, με συμμετοχή του μεταιχμιακού συστήματος. Οι α2 νοραδρενεργικοί υποδοχείς στο ενδιάμεσο τμήμα του κοιλιακού υπερ-ραβδωτού συμμετέχουν στο σχηματισμό μνήμης αρνητικών ερεθισμάτων. Ο αριθμός τους αυξάνεται μετά από μαθησιακή δοκιμασία (μονοσυνεδριακή εκπαίδευση παθητικής αποφυγής ερεθίσματος) και απενεργοποίησή τους με χορήγηση ανταγωνιστή (ραουβολσίνη) προκαλεί αμνησία. Συμπερασματικά, η ΝΟ. και οι α2 νοραδρενεργικοί υποδοχείς ασκούν δράση σε πλαστικά φαινόμενα κατά τη φυσιολογική ανάπτυξη (σχηματισμός συνάψεων, ωρίμαση νευρικών συνδέσεων). Η ΝΟ. πιθανά ρυθμίζει τη γέννηση ή/και τη μετανάστευση κυττάρων. Οι α2 υποδοχείς συμμετέχουν στην αναδιοργάνωση του νευρικού συστήματος μετά από τραυματισμό του καθώς και στο σχηματισμό ή/και την ανάκληση μνήμης.