Assessing the potential role of Rictor expression as predictive factor of response to PI3K/mTOR pathway inhibitors in preclinical models of squamous cell lung cancer

Abstract

Squamous cell lung cancer (SQLC) is the second most prevalent histologic type of lung cancer and accounting for approximately 30% of newly diagnosed non-small cell lung cancer (NSCLC) cases. Systemic treatments for SQLC patients include cytotoxic chemotherapy and immune-oncology approaches. In contrast with lung adenocarcinoma, which is the other main subtype of NSCLC, no patient-tailored treatments are available so far for SQLC. Accumulating evidence suggests that the PI3K/mTOR axis is one of the most frequently altered pathways in SQLC. However, despite a plethora of clinical trials with numerous PI3K/mTOR targeted inhibitors, no significant increase in patients’ survival has been observed as compared to standard treatment options. A possible explanation for the outcome of those clinical trials might be the lack of reliable predictive biomarkers for better patients’ stratification. We and others have reported Rictor copy number gain (CNG) in a set of SQLC patients by performing targeted DNA sequencing on archival tissues. Another group has suggested the existence of Rictor focal amplification in subsets of lung cancers, including SQLC, and further suggested Rictor as a potential predictive biomarker of response to targeted therapy. However, no conclusive data were presented to show that Rictor amplification is driving activation of the PI3K/mTOR pathway in SQLC cells or representing a valid biomarker predictive of response to targeted inhibition of the pathway. Here, we used three different SQLC cell lines and 60 tissue specimens to show that CNG of Rictor is a recurrent event in SQLC, yet this is due to the polysomy of the short arm of chromosome 5 rather than to focal amplification. All three cell lines tested showed different Rictor CNG and different levels of its transcript and protein. In particular, the SQLC cell line harboring the higher CNG (H-1869) accordingly displayed higher level of Rictor protein. Therefore, we sought to test the possibility that the dosage of Rictor might affect the activation of PI3K/mTOR pathway and sensitivity towards its targeting agents. Unexpectedly, we found that Rictor levels did not parallel the biochemical activation of the pathway nor the sensitivity to dual mTORC1/C2 or PI3K/mTOR inhibitions. These observations were confirmed by genetic perturbation analysis, as reduction of Rictor levels through RNA interference did not lead neither to reduced cell viability nor to significant changes in drug sensitivity in the two cell lines tested. Overall, our findings suggest that Rictor does not represent a predictive biomarker of response towards PI3K/mTOR directed therapy.

Το πλακώδες καρκίνωμα του πνεύμονα (ΠΚΠ) είναι ο δεύτερος πιο διαδεδομένος ιστολογικός τύπος καρκίνου του πνεύμονα και αντιπροσωπεύει περίπου το 30% των νέων περιπτώσεων μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (ΜΜΚΠ). Οι συστηματικές θεραπείες για ασθενείς με ΠΚΠ περιλαμβάνουν προσεγγίσεις κυτταροτοξικής χημειοθεραπείας και ανοσοογκολογίας. Σε αντίθεση με το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, που είναι ο άλλος κύριος υποτύπος του ΜΜΚΠ, δεν υπάρχουν μέχρι στιγμής διαθέσιμες θεραπείες προσαρμοσμένες στον ασθενή για το ΠΚΠ. Τα συσσωρευμένα στοιχεία υποδηλώνουν ότι ο άξονας PI3K/mTOR είναι ένα από τα μονοπάτια που αλλάζουν πιο συχνά στο ΠΚΠ. Ωστόσο, παρά την πληθώρα κλινικών δοκιμών με πολλούς στοχευμένους αναστολείς PI3K/mTOR, δεν έχει παρατηρηθεί σημαντική αύξηση στην επιβίωση των ασθενών σε σύγκριση με τις τυπικές θεραπευτικές επιλογές. Μια πιθανή εξήγηση για το αποτέλεσμα αυτών των κλινικών δοκιμών μπορεί να είναι η έλλειψη αξιόπιστων προγνωστικών βιοδεικτών για καλύτερη κατηγοριοποίηση των ασθενών. Εμείς όπως και άλλοι έχουμε αναφέρει αύξηση αριθμού αντιγράφων του γονιδίου Rictor (CNG) σε ένα σύνολο ασθενών με ΠΚΠ πραγματοποιώντας στοχευμένη αλληλουχία DNA σε αρχειακούς ιστούς. Μια άλλη ομάδα πρότεινε την ύπαρξη εστιακής ενίσχυσης του γονιδίου Rictor σε υποομάδες καρκίνων του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένου του ΠΚΠ, και πρότεινε περαιτέρω το Rictor ως πιθανό προγνωστικό βιοδείκτη ανταπόκρισης σε στοχευμένη θεραπεία. Ωστόσο, δεν παρουσιάστηκαν οριστικά δεδομένα που να δείχνουν ότι η ενίσχυση του γονιδίου Rictor οδηγεί σε ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού PI3K/mTOR σε κύτταρα ΠΚΠ ή αντιπροσωπεύει έναν έγκυρο βιοδείκτη που προγνωστοποιεί την απόκριση στη στοχευμένη αναστολή της οδού. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές ΠΚΠ και 60 δείγματα ιστού για να δείξουμε ότι το CNG του Rictor είναι ένα επαναλαμβανόμενο συμβάν στο ΠΚΠ, ωστόσο αυτό οφείλεται στην πολυσωμία του μικρού βραχίονα του χρωμοσώματος 5 και όχι στην εστιακή ενίσχυση. Και οι τρεις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν έδειξαν διαφορετικό Rictor CNG και διαφορετικά επίπεδα μεταγραφής και πρωτεΐνης του. Συγκεκριμένα, η κυτταρική σειρά ΠΚΠ που περιέχει το υψηλότερο CNG (H-1869) επέδειξε αντίστοιχα υψηλότερο επίπεδο πρωτεΐνης Rictor. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να ελέγξουμε την πιθανότητα ότι η δόση του γονιδίου Rictor μπορεί να επηρεάσει την ενεργοποίηση της οδού PI3K/mTOR και την ευαισθησία προς τους παράγοντες στόχευσής του. Απροσδόκητα, διαπιστώσαμε ότι τα επίπεδα του γονιδίου Rictor δεν ήταν παράλληλα με τη βιοχημική ενεργοποίηση της οδού ούτε με την ευαισθησία σε διπλούς αναστολείς mTORC1/C2 ή PI3K/mTOR. Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση γενετικής διαταραχής, καθώς η μείωση των επιπέδων Rictor μέσω παρεμβολής RNA δεν οδήγησε ούτε σε μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα ούτε σε σημαντικές αλλαγές στην ευαισθησία του φαρμάκου στις δύο κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Συνολικά, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι το Rictor δεν αντιπροσωπεύει έναν προγνωστικό βιοδείκτη ανταπόκρισης στην κατευθυνόμενη θεραπεία με PI3K/mTOR.