Φωταυγή σύμπλοκα χαλκού και αργύρου και μελέτη της αντιβακτηριακής και αντικαρκινικής τους δράσης

Abstract

In view of the imminent threat of development of resistance by eukaryotic cancer cells to common anticancer drugs, as well as by bacterial cells to common antibiotics, in recent years scientific research efforts have been intensified towards the design and development of novel and more effective chemotherapeutic agents. One of the approaches of modern research in this direction includes the design, development, and investigation of the anticancer and antibacterial activity of transition metal complexes. With the exception of Pt group complexes, which have been extensively studied and used in anticancer therapies, Group 11 metal complexes are also of great interest. Of these, Cu and Ag complexes have been studied to a lesser extent, a fact that is, partly, related to the usually low kinetic stability of their complexes in aqueous biological media which, ultimately has a detrimental effect on their expected bioactivity.In the context of this PhD thesis, the synthesis and characterization of new heteroleptic complexes of Cu(I) and Ag(I) bearing as ligands heterocyclic thioamides in combination with phosphines (e.g. PPh3) or biphosphines (P^P) or N-heterocyclic carbenes (NHC) was carried out as well as the study of their in vitro antimicrobial and anticancer activity. The use of the particular ligands having S, P and C donor atoms intends to kinetically stabilize their respective complexes, through the development of favorable soft base/Lewis acid interactions with metal ions and the combination of chelating effect for the bisphosphine containing complexes. Also, the individual steric and electronic characteristics of the ligands (e.g. size of heterocyclic ring, ring group-substituents) have a direct effect on the structural and chemical characteristics of their respective complexes, influencing their biological activity, which allows the documentation of structure-bioactivity relationships.The determination of the crystal structures of the complexes presented in this thesis was carried out by the X-ray diffraction crystallography. Also, all the complexes were characterized in the solid state by FTIR spectroscopy while their 1H NMR and UV-vis absorption spectroscopy data suggest the stability of the structures of the complexes in solutions for long periods of time. Also, fluorescence spectroscopy measurements in solution revealed the luminescent character of the complexes, as they show emission bands with maxima covering the 400-450 nm wavelength range. The photophysical characteristics were deemed suitable for the further application of the complexes in biodiagnostics.The first group of complexes presented herein includes neutral and cationic complexes of Ag(I) with the NH2- or CF3-substituted five-membered ring heterocyclic thioamides 5-amino-1,3,4-thiadiazole-2(3H)-thione (atdztH) and 4-methyl-5-(trifluoromethyl)-4H-1,2,4-triazol-3-thiol (mtftH) in combination with phosphines or biphosphines. Studies of their in vitro antibacterial activity against selected Gram (+) and Gram (–) bacteria cell lines and their cytotoxic activity against selected human cancer cell lines demonstrate the determining effect of the NH2-substitution of the heterocyclic thioamide on the bioactivity of the complexes compared to the complexes bearing the CF3-substituted heterocyclic thioamide. In an attempt to clarify their possible mechanism of action, the complexes were studied in terms of their in vitro antioxidant activity, their interaction with calf-thymus (CT) DNA which is the main target biomolecule of antibacterial and anticancer compounds, with serum albumins which function as drug transporters. Finally, computational molecular docking studies of the compounds to E. coli DNA gyrase and fibroblast growth factor receptor 1 FGFR-1 overexpressed in cancer cells were also performed. For comparison reasons and further investigation of the effect of functional groups of heterocyclic thioamides, a group of analogous Ag(I) complexes with the five-membered ring heterocyclic thioamide with CH3-substitution 5-methyl-1,3,4-thiadiazole-2(3H)-thione (mtdztH) was also synthesized. In vitro antimicrobial studies indicated the more effective bioactivity of the mtdztH-containing complexes compared to the Ag(I) complexes with atdztH, while in vitro anticancer studies indicated their lower selectivity compared to Ag(I) complexes bearing atdztH, in normal MRC-5 lung cells.Also, the synthesis and study of the in vitro antibacterial and anticancer activity of a series of heteroleptic cationic or neutral complexes of Ag(I) with the six-membered ring heterocyclic thioamide 4,6-dimethyl-2-pyrimidinethiol (dmp2SH) and phosphines were carried out. The individual structural characteristics of the complexes have a great impact on their bioactivity, with the mononuclear cationic or neutral complexes having an unsaturated coordination sphere of the metal showing higher antibacterial efficacy, mainly against the Gram (+) bacteria studied. In addition, the particular complexes showed high anticancer activity with a selective character towards cervical cancer cells compared to breast cancer cells and remarkably low cytotoxicity towards normal fibroblast cells. The bioactivity of the compounds was studied in combination with their excellent photophysical emission properties, offering the possibility of application in bioimaging studies to determine their biodistribution in cervical cancer cells. In vitro binding of the complexes to serum albumins and calf-thymus DNA in combination with molecular modeling calculations provided further insight into possible mechanisms of bioactivity by exploring their ability to act as potential inhibitors of DNA-gyrase, human papillomavirus E6 oncoprotein and other biomolecules. In the same context, aiming to study the effect of the substituent-groups of the six-membered ring heterocyclic thioamides, as well as the metal ion, on the bioactivity, a series of complexes of Ag(I) and Cu(I) with 4,6-diamino-2-pyrimidinethiol (dap2SH) and different phosphines was also synthesized. These complexes displayed superior activity against the Gram (–) bacteria than their analogous Ag(I) complexes with the dmp2SH. However, dap2SH containting Ag(I) and Cu(I) complexes devoid the appropriate selectivity to normal cells while showing toxicity to all of the tested cell lines. High antioxidant capacity was observed for this new series of compounds which efficiently contributed to free radicals scavenging of DPPH, ABTS and H2O2 reduction.The synthesis of a series of complexes of Ag(I) and Cu(I) with the heterocyclic thioamide 2-mercaptopyrimidine (pymtH) in combination with the diphosphine 4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene (xantphos) or the N-heterocyclic carbene 1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-1H-imidazol-3-ium-2-ide (IPr) was also carried out with the aim to investigate the effect of auxiliary ligands on the in vitro bioactivity of their respective complexes. From the in vitro antibacterial studies of the complexes against selected Gram (+) and Gram (‒) bacteria as well as the in vitro antitumor activity studies against selected human cancer cell lines, it was found that the Ag(I) and Cu(I) complexes bearing IPr outperform the structurally analogous complexes with xantphos in terms of their bioactivity efficacy, showing significantly low values of inhibition concentrations of bacterial and cell proliferation. Furthermore, cytometry analysis suggested that the complexes exterted their cytotoxic effect through an apoptotic pathway.Finally, the three most effective in terms of their in vitro anticancer activity, but lipophilic, complexes of Ag(I) with dmp2SH were encapsulated in a suitable amphiphilic and biodegradable copolymer, methoxy-poly(ethylene glycol)-poly(caprolactone) (mPEG-PCL), in order to develop drug delivery systems to improve their solubility and pharmacokinetic properties in biological media ensure their effective delivery at target sites. Exploitation of the favorable Lewis acid-base interactions and electrostatic interactions between the complexes and the copolymer led to the formation of spherically shaped nanoparticles, with high drug loading capacities (13-15%) and high encapsulation efficiencies (80-88%). The nanoparticles of the complexes vary in size (200-600 nm) yet show very similar in vitro release profiles in both neutral and acidic pH, characterized by two main stages, an initial burst stage lasting 2 days followed by a prolonged released stage which was extended for 15 days. Finally, the in vitro cytotoxicity of the complexes seems to be improved after their encapsulation in mPEG-PCL compared to their free form, against cervical cancer cells, indicating that the new delivery systems increase their antitumor activity with concentration values inhibition of cell viability 8 times lower compared to the corresponding concentrations of the compounds in their free form.

Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας από πολλά ευκαρυωτικά καρκινικά κύτταρα στα συνήθη αντικαρκινικά φάρμακα, όπως επίσης και πολλών βακτηριακών κυττάρων στα κοινά αντιοβιοτικά, έχει εντείνει, τα τελευταία χρόνια, τις ερευνητικές επιστημονικές προσπάθειες για τον σχεδιασμό και την ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικότερων χημειοθεραπευτικών μέσων. Μια από τις προσεγγίσεις της σύγχρονης έρευνας προς την κατεύθυνση αυτή περιλαμβάνει το σχεδιασμό, την ανάπτυξη και τη διερεύνηση της αντικαρκινικής και αντιβακτηριακής δραστικότητας συμπλόκων μεταβατικών μετάλλων. Με εξαίρεση τα σύμπλοκα της ομάδας του Pt, τα οποία έχουν μελετηθεί και χρησιμοποιούνται εκτενώς σε αντικαρκινικές θεραπείες, ενδιαφέρον επίσης παρουσιάζουν τα σύμπλοκα των μετάλλων της Ομάδας 11. Από αυτά, τα σύμπλοκα του Cu και του Ag έχουν μελετηθεί σε μικρότερο βαθμό, γεγονός που, μερικώς, σχετίζεται με τη συνήθως χαμηλή κινητική τους σταθερότητα σε υδατικά βιολογικά μέσα, εξαιτίας της οποία πιθανώς να ελαττώνεται η βιοδραστικότητά τους. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε η σύνθεση και ο χαρακτηρισμός νέων ετεροληπτικών συμπλόκων του Cu(I) και του Ag(I) που φέρουν ως ligand ετεροκυκλικά θειοαμίδια σε συνδυασμό με φωσφίνες (π.χ. PPh3) ή διφωσφίνες (P^P) ή Ν-ετεροκυκλικά καρβένια (ΝΗC), καθώς και η μελέτη της in vitro αντιμικροβιακής και αντικαρκινικής τους δραστικότητας. Η χρήση των συγκεκριμένων ligand με δότες άτομα S, P και C έχει σκοπό την κινητική σταθεροποίηση των αντίστοιχων συμπλόκων τους, μέσω της ανάπτυξης ευνοϊκών αλληλεπιδράσεων μαλακών βάσεων/οξέων Lewis με τα ιόντα των δύο μετάλλων, σε συνδυασμό με την επίδραση χηλικού φαινομένου για τις διφωσφίνες. Επίσης, τα ιδιαίτερα στερεοχημικά και ηλεκτρονικά χαρακτηριστικά των ligand (π.χ. μέγεθος ετεροκυκλικού δακτυλίου, υποκαταστάτες δακτυλίου) έχουν άμεση επίδραση στα δομικά και χημικά χαρακτηριστικά των αντίστοιχων συμπλόκων τους, επηρεάζοντας και τη βιολογική τους δραστικότητα με διαφορετικό τρόπο, επιτρέποντας τελικά, την τεκμηρίωση της σχέσης δομής-βιοδραστικότητας. Ο προσδιορισμός των κρυσταλλικών δομών των σύμπλοκων που παρουσιάζονται στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της κρυσταλλογραφίας περίθλασης ακτίνων Χ. Όλα τα σύμπλοκα χαρακτηρίστηκαν στη στερεά κατάσταση με φασματοσκοπία FTIR ενώ τα δεδομένα φασματοσκοπίας NMR και UV-vis απορρόφησης προτείνουν τη σταθερότητα των δομών των συμπλόκων σε διαλύματά τους για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Επίσης, από τη φασματοσκοπία φθορισμού σε διαλύματα των συμπλόκων, αποκαλύφθηκε ο φωταυγής χαρακτήρας τους, καθώς εμφανίζουν ταινίες εκπομπής με μέγιστα που καλύπτουν την περιοχή μηκών κύματος 400-450 nm. Τα φωτοφυσικά χαρακτηριστικά κρίθηκαν κατάλληλα για την περαιτέρω εφαρμογή των συμπλόκων στη βιοδιαγνωστική. Η πρώτη ομάδα συμπλόκων που παρουσιάζονται περιλαμβάνει ουδέτερα και κατιοντικά σύμπλοκα του Ag(I) με τα ΝΗ2- ή CF3- υποκατεστημένα ετεροκυκλικά θειοαμίδια πενταμελούς δακτυλίου 5-amino-1,3,4-thiadiazole-2(3H)-thione (atdztH) και 4-methyl-5-(trifluoromethyl)-4H-1,2,4-triazol-3-thiol (mtftH) σε συνδυασμό με φωσφίνες ή διφωσφίνες. Μελέτες της in vitro αντιβακτηριακής δραστικότητας έναντι επιλεγμένων σειρών Gram (+) και Gram (–) βακτηρίων και της κυτταροτοξικής τους δραστικότητας έναντι επιλεγμένων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, αποδεικνύουν την ισχυρή επίδραση της ΝΗ2-υποκαταστάσης του ετεροκυκλικού θειοαμιδίου στην βιοδραστικότητα των συμπλόκων συγκριτικά με τα σύμπλοκα που φέρουν το CF3-υποκαταστεστημένο ετεροκυκλικό θειοαμίδιο. Στην προσπάθεια αποσαφήνισης του πιθανού μηχανισμού δράσης τους, τα σύμπλοκα μελετήθηκαν ως προς την in vitro αντιοξειδωτική τους δραστικότητα, την αλληλεπίδρασή τους με το calf-thymus (CT) DNA που αποτελεί κύριο βιομόριο-στόχο των αντιβακτηριακών και αντικαρκινικών ενώσεων, με τις αλβουμίνες ορού που λειτουργούν ως μεταφορείς φαρμάκων, ενώ επίσης διεξήχθησαν υπολογιστικές μελέτες μοριακής πρόσδεσης των ενώσεων στη DNA-γυράση του βακτηρίου E. coli και στον υποδοχέα 1 του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών FGFR-1 που υπέρκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα. Για λόγους σύγκρισης και περαιτέρω διερεύνησης της επίδρασης των λειτουργικών ομάδων των ετεροκυκλικών θειοαμιδίων, συντέθηκε μία ομάδα ανάλογων συμπλόκων του Ag(I) με το επίσης μικρού μεγέθους ετεροκυκλικό θειοαμίδιο με CH3-υποκατάσταση 5-methyl-1,3,4-thiadiazole-2(3H)-thione (mtdztH). Οι in vitro αντιμικροβιακές μελέτες υπέδειξαν την αποτελεσματικότερη δραστικότητα των συμπλόκων του mtdztH ως προς με τα ανάλογα σύμπλοκα του Ag(I) με το atdztH, ενώ οι in vitro αντικαρκινικές μελέτες υπέδειξαν τη μικρότερη εκλεκτικότητα τους συγκρτικά με τα σύμπλοκα Ag(I) που φέρουν το atdztH, ως προς τα φυσιολογικά κύτταρα των πνευμόνων MRC-5.Επίσης, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση και η μελέτη της in vitro αντιβακτηριακής και αντικαρκινικής δραστικότητας μιας σειράς ετεροληπτικών κατιοντικών ή ουδέτερων συμπλόκων του Ag(I) με το ετεροκυκλικό θειοαμίδιο εξαμελούς δακτυλίου 4,6-dimethyl-2-pyrimidinethiol (dmp2SH) και φωσφίνες. Τα ιδιαίτερα δομικά χαρακτηριστικά των συμπλόκων επηρεάζουν την βιοδραστικότητά τους, με τα μονοπυρηνικά κατιοντικά ή ουδέτερα σύμπλοκα που έχουν ακόρεστη σφαίρα συναρμογής του μετάλλου να εμφανίζουν ισχυρή αντιβακτηριακή αποτελεσματικότητα, κυρίως ως προς τα Gram (+) βακτήρια που μελετήθηκαν. Επιπλέον, τα συγκεκριμένα σύμπλοκα εμφάνισαν ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα με εκλεκτικό χαρακτήρα ως προς τα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας συγκριτικά με τα καρκινικά κύτταρα του μαστού και αξιοσημείωτα χαμηλή κυτταροτοξικότητα ως προς τα φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών. Η βιοδραστικότητα των ενώσεων μελετήθηκε σε συνδυασμό με τις εξαιρετικές φωτοφυσικές ιδιότητες εκπομπής τους, που προσεφέραν τη δυνατότητα της εφαρμογής σε βιοαπεικονιστικές μελέτες για τον προσδιορισμό της βιοκατανομής τους στα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. Ιn vitro και in silico μελέτες αλληλεπίδρασης με βιομόρια στόχους, όπως CT DNA, ογκοπρωτεΐνη του Ε6 του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων, προσέφεραν χρήσιμες πληροφορίες για την προσέγγιση του πιθανού μηχανισμού δράσης των συμπλόκων. Στη συνέχεια, στοχεύοντας στη μελέτη της επίδρασης των διαφορετικών μεταλλικών ιόντων και των υποκαταστατών των ετεροκυκλικών θειοαμιδίων εξαμελούς δακτυλίου στη βιοδραστικότητα, συντέθηκαν ανάλογα με τα παραπάνω σύμπλοκα του Cu(I) και του Ag(I) αλλά με το 4,6-diamino-2-pyrimidinethiol (dap2SH) και διαφορετικές φωσφίνες. Τα νέα σύμπλοκα εμφάνισαν αποτελεσματική δραστικότητα ως προς τα Gram (–) βακτήρια συγκριτικά με τα λιγότερο αποτελεσματικά σύμπλοκα του Ag(Ι) με το dmp2SH, ωστόσο υπήρξαν μη εκλεκτικά ως προς τα καρκινικά και υγιή κύτταρα κατά την αξιολόγηση της in vitro αντικαρκινικής τους δραστικότητας. Τέλος, αντιοξειδωτικές μελέτες που ακολούθησαν έδειξαν ότι οι ενώσεις είναι ικανές να δεσμεύουν τις ελέυθερες ρίζες των DPPH, ABTS και να προκαλούν αναγωγή του υπεροξειδίου του υδρογόνου.Η σύνθεση μίας σειράς συμπλόκων του Cu(I) και του Ag(I) με το ετεροκυκλικό θειοαμίδιο 2-mercaptopyrimidine (pymtH) σε συνδυασμό με τη διφωσφίνη 4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene (xantphos) ή το Ν-ετεροκυκλικό καρβένιo 1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-1H-imidazol-3-ium-2-ide (IPr) επίσης πραγματοποιήθηκε με σκοπό τη διερεύνηση της επίδρασης των βοηθητικών ligand στην in vitro βιοδραστικότητά των αντίστοιχων συμπλόκων τους. Από τις in vitro αντιβακτηριακές μελέτες ως προς επιλεγμένα Gram (+) και Gram (‒) βακτήρια και την in vitro δοκιμασία αντικαρκινικής δραστικότητάς σε επιλεγμένες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές βρέθηκε ότι τα σύμπλοκα του Ag(I) και του Cu(I) που φέρουν το IPr υπερτερούν των δομικώς ανάλογων συμπλόκων με το xantphos ως προς την αποτελεσματικότητα τους, εμφανίζοντας σημαντικά χαμηλές τιμές συγκεντρώσεων αναστολής του βακτηριακού και κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η δραστικότητα των συμπλόκων με το IPr εξετάστηκε περαιτέρω με κυτταρομετρία ροής (δοκιμασία απόπτωσης) ώστε να προσδιοριστεί ο μηχανισμός του κυτταρικού θανάτου.Τέλος, τα τρία αποτελεσματικότερα ως προς την αντικαρκινική τους δραστικότητα, αλλά λιπόφιλα, σύμπλοκα του Ag(I) με το dmp2SH ενθυλακώθηκαν σε κατάλληλο αμφίφιλο συμπολυμερές methoxy-poly(ethylene glycol)-poly(caprolactone) (mPEG-PCL) με σκοπό την ανάπτυξη νανοσυστημάτων χορήγησής τους (drug delivery systems) που πρόκεται να βελτιώσουν τη διαλυτότητα και τις φαρμακοκινητικές ιδιότητες τους σε βιολογικά μέσα. Η αξιοποίηση των ευνοϊκών αλληλεπιδράσεων οξέος-βάσεως Lewis και των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των συμπλόκων και του συμπολυμερούς οδήγησε στο σχηματισμό νανοσωματιδίων σφαιρικού σχήματος, εξαιρετικά υψηλών ποσοστών φόρτωσης φαρμάκου (13-15%) και υψηλών αποδόσεων ενθηλάκωσης (80-88%). Τα νανοσωματίδια των συμπλόκων διαφοροποιούνται ως προς τα μεγέθη (200-600 nm) ωστόσο εμφανίζουν παρόμοια προφίλ απελευθέρωσης των συμπλόκων δύο σταδίων, απότομης απελευθέρωσης (2 ημέρες) και παρατεταμένης απελευθέρωσης (15 ημέρες), σε ουδέτερο και όξινο pH. Τέλος, η in vitro κυτταροτοξικότητα των συμπλόκων φαίνεται να βελτιώνεται κατόπιν την ενθηλάκωσής τους στο mPEG-PCL συγκριτικά με την ελεύθερη μορφή τους, ως προς τα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας, υποδεικνύοντας ότι τα νέα συστήματα χορήγησης αυξάνουν την αντικαρκινική τους δραστικότητα με τιμές συγκεντρώσεων αναστολής της κυτταρικής βιωσιμότητα 8 φορές μικρότερες συγκριτικά με τις αντίστοιχες των ελεύθερων ενώσεων.