Διεργασίες ανάκτησης και καθαρισμού των καροτενοειδών που παράγονται από το μύκητα Blakeslea trispora σε διαφορετικά υποστρώματα

Abstract

The carotenoids are one of the most widely distributed groups of natural pigments, and in addition to their attractive colour they also provide multidimensional benefits for the human health. The continuously growing market of carotenoids and the demand for more amounts, in accordance with the consumers’ desire for all natural products and for friendly to environment chemicals production, brings always the carotenoids biotechnological production in intense research interest. The carotenoids are intracellular products and due to their unique physical and chemical properties make the design of their downstream processing crucial financial factor for the overall process. The present thesis is mainly dealing with the downstream processing and production of carotenoids from Blakeslea trispora cultures in a integrated manner that have never treated before. In the first five chapters (Chapt 6-11) of the experimental part of the thesis the carotenoids production, their recovery and their purification are considered. In the next three last chapters (Chapt 12-14) the use of initial extract without further purification is evaluated. Biomass pre-treatment and the use of different solvents for carotenoid isolation and recovery are firstly examined. It has been proved that the carotenoid recovery from wet biomass, just after its filtration and washing without further treatment, was superior that of dry. The other ways of biomass pre-treatment lead to great carotenoid loss. Except the biomass pre-treatment a number of other parameters are considered to affect their isolation, for example the substrate used in each case, the biomass autoclaving and the extraction procedure. From the examined solvents for carotenoid recovery from wet biomass the most appropriate seemed to be, with the order given here, diethyl ether, 2-propanol and ethanol. Additionally it has been proved that the proper solvent selection and use could lead to enriched fraction of β-carotene or lycopene without any other treatment. The substrate contribution in the three main carotenoids production was also examined, showing that natural oils give higher carotenoid production in contrast with the use only of the linoleic acid. The substrate with lactose as main carbon source gives higher β-carotene percentage than the rest examined substrates, with the disadvantage of poorer fungus growth. On the other hand, starch as the main carbon source leads to higher both carotenoid production and fungus growth, making this choice very attractive. Metal ions, butylated hydroxytoluene (antioxidant), vitamins, NaCl concentration and the addition of different surfactant amounts were also examined and proved to considerably affect the main carotenoid production. Raman spectroscopy used for the carotenoid production in terms of their intracellular monitoring. Such approach makes the study of carotenoid production easier and more rapid, avoiding the artifacts that arise from their isolation procedures. It seems that Raman spectroscopy could alternatively be used for carotenoid evaluation. The subsequent removal of extraction contaminants that do not allow the carotenoid crystallization was attempted by means of mild saponification conditions. This study has shown that the carotenoid extraction, the saponification and a later hexane extraction step could be efficiently performed in one stage only, without significant carotenoid losses. This could lead to shorter times and operation costs. The carotenoid purification was also examined with the classical chromatographic procedures and the results of this analysis indicated that the basic aluminum oxide II could lead to almost purified carotenoid fractions enriched in β-carotene, γ-carotene and lycopene at a level of 88, 93 and 55% respectively. The possibility of more reliable and faster purification procedures was also examined with the production and evaluation of high-tech molecular imprinted polymers. The evaluation of these materials performed with batch rebinding experiments, as well as with their use in solid phase extraction experiments, giving results that are useful for further development and use of such materials in the isolation and the purification of the initial carotenoids extract. In the three last chapters of this thesis the possibility of use the initial carotenoid extract without purification was examined. Firstly the synergistic antioxidant effect of this extract was proved, as well as that this synergism is also depended from substrate in which fungus was growing. The extracts from different cultures exhibit variation in antioxidant capacity and synergism. Afterwards, the carotenoid extract was encapsulated into edible carriers, such as natural biodegradable polymers and liposome-niosome. This encapsulation procedure could be employed for carotenoid collection in solid state, and their controlled release.

Τα καροτενοειδή αποτελούν μια από τις σπουδαιότερες κατηγορίες φυσικών χρωστικών και εκτός του χρώματός τους έχουν πολλαπλή ευεργετική δράση στον ανθρώπινο οργανισμό. Η συνεχώς αυξανόμενη ζήτηση ολοένα και μεγαλύτερων ποσοτήτων καροτενοειδών, αλλά και η ευαισθητοποίηση σήμερα των ανθρώπων τόσο όσον αφορά περιβαλλοντικά θέματα, όσο και την επιθυμία τους για χρήση φυσικά παραγόμενων προϊόντων, καθιστά την ανάγκη βιοτεχνολογικής παραγωγής τους σημείο έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος. Για το λόγο ότι τα καροτενοειδή είναι ενδοκυττάριο προϊόν και λόγω των ιδιαίτερων φυσικοχημικών τους ιδιοτήτων ο σχεδιασμός της διεργασίας ανάκτησής τους αποτελεί σημαντικό οικονομικό μέγεθος της όλης διαδικασίας. Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκε η παραγωγή και κυρίως η ανάκτηση των καροτενοειδών από τις καλλιέργειες του μύκητα Blakeslea trispora. Εξετάστηκε η επίδραση της προκατεργασίας της βιομάζας και η χρήση διαφόρων διαλυτών για την ανάκτηση των καροτενοειδών από τη βιομάζα του μύκητα και αποδείχθηκε ότι η ανάκτησή τους από την υγρή βιομάζα αμέσως μετά το πέρας της καλλιέργειας, χωρίς περαιτέρω κατεργασία, είναι η πλέον ενδεδειγμένη. Επίσης δείχθηκε ότι με την επιλογή κατάλληλων διαλυτών μπορούν να ληφθούν από την αρχική εκχύλιση κιόλας κλάσματα εμπλουτισμένα σε β-καροτένιο ή λυκοπένιο. Εκτός της προκατεργασίας της βιομάζας και τον εκάστοτε χρησιμοποιούμενο διαλύτη πλήθος παραγόντων βρέθηκε ότι επηρεάζουν την εκχύλιση και τα λαμβανόμενα καροτενοειδή. Μελετήθηκε η συνεισφορά των συστατικών του υποστρώματος στα επιμέρους παραγόμενα καροτενοειδή όπως η κύρια πηγή άνθρακα, τα φυτικά έλαια, τα ιόντα μετάλλων, το βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (αντιοξειδωτικό), οι βιταμίνες, η συγκέντρωση χλωριούχου νατρίου και η παρουσία διαφορετικών ποσοτήτων επιφανειοδραστικών και βρέθηκε ότι όλα τα παραπάνω επηρεάζουν σημαντικά τα επι μέρους παραγόμενα καροτενοειδή, με διαφορετικά κάθε φορά αποτελέσματα. Μελετήθηκε επίσης η πορείας της ενδοκυτταρικής παραγωγής των καροτενοειδών σε καλλιέργειες του B. trispora με τη βοήθεια της φασματοσκοπίας Raman. Στη συνέχεια επιχειρήθηκε απομάκρυνση των ουσιών που παρεμποδίζουν την κρυστάλλωση των καροτενοειδών, υπό ήπιες συνθήκες σαπωνοποίησης, καθώς και ο καθαρισμός και ο διαχωρισμός των καροτενοειδών με χρωματογραφικές μεθόδους. Η πιθανότητα αποτελεσματικότερου και ταχύτερου καθαρισμού του αρχικού εκχυλίσματος εξετάστηκε με τη χρήση των τεχνολογικά προηγμένων πολυμερών μοριακής αποτύπωσης. Τέλος εξετάστηκε η αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος των καροτενοειδών, και βρέθηκε ότι επηρεάζεται σημαντικά από τη σύσταση των υποστρωμάτων στα οποία ο μύκητας αναπτύσσεται, καθώς και ο εγκλεισμός του μείγματος των καροτενοειδών σε βρώσιμους φορείς, όπως είναι τα βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή και τα νιοσώματα-λιποσώματα.