Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών του ιού του μωσαϊκού του Solanum muricatum και της τομάτας και μελέτη του ρόλου ιικών-φυτικών πρωτεϊνών στην καταστολή σίγησης του RNA και την αναπαραγωγή του ιού

Abstract

(+)RNA viruses for a successful infection require except their RNA genome, viral-encoded proteins and also host machineries/pathways. By this way viruses can counteract host defenses and facilitating their vital functions, finally posing the plant under their control. The identification of host factors and the dissection of their roles in the viral replication cycle contributes to a better understanding of viral mechanisms during viral-host interactions, and indicate potential new control strategies against viral diseases. In the present work, three tomato proteins were identified to interact with Pepino mosaic virus (PepMV)-encoded proteins and their implication into viral replication and the suppression of RNA silencing was investigated. Of the three Hsc70 genes which were cloned in this study, only Hsc70.3 was shown to interact with CP in the cytoplasm, the nucleus, and as inclusion bodies. During PepMV infection in tomato plants, induction of Hsc70 mRNA and protein levels was observed, accumulation and its co-localization with PepMV-viroplasm as well as immunodetection together with purified PepMV-virions. The above data suggest an active role of Hsc70 in virus infection through its binding with CP, a protein also involved in potexviruses movement. The silence of Hsp70 in N. benthamiana plants had as a result a dramatic reduction in the systemic virus detection, and similar results were observed also in the approach using quercetin. Conclusively, these results demonstrate an important role of Ηsp70/CP interaction possibly in virus movement. p25 was verified as protein interactor of the catalase and their subcellular localization revealed their presence in the cytoplasm and the nucleus, in agreement with the identified sites of their interaction. The PepMV infection of tomato plants had no effect in the variation of mRNA and protein levels, but instead a specific induction of catalase activity was recorded and vice versa with the presence of H2O2. Further analysis showed that the increased enzyme activity was specifically due to the p25 interaction, probably mediated suppression of the plant oxidative stress defense mechanism in virus favour since catalase gene silencing studies in N. benthamiana plants showed that high catalase activity ensures high virus levels. Screening of four PepMV-proteins to study their role in the RNA silencing mechanism revealed that p25 and CP, exhibited different suppressing activities and mechanisms of action, and probably targeted different steps of the PTGS. These data constitute the first report of CP as a PTGS-suppressor in the Potexvirus genus, and also the dual role of p25 in the suppression of two different defense mechanisms, RNA silencing and oxidative stress. The multifunctional p25 protein was also demonstrated to interact with a tomato protein that includes a thioredoxin domain and this protein was phylogenetically related to the thioredoxin type z proteins, a category of proteins related with the oxidative stress as synergistic regulators of antioxidant enzymes functions. Finally, interactions were observed between p25 and CP, confirming the interactions postulated by the potexviruses movement strategy-model and supporting the existence of conserved interactions within the Potexvirus genus as these proteins constitute structural elements of the movement complex.

Ιοί με (+)RNA γονιδίωμα χρησιμοποιούν για την επιτυχή μόλυνση εκτώς από το γονιδίωμά τους κωδικοποιημένες από αυτό πρωτεΐνες καθώς και δομικά υλικά και μηχανισμούς του ξενιστή. Οι αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα κατά τη μόλυνση μέσα στο φυτό καθορίζουν την εξέλιξη της ασθένειας ως μια πάλη μεταξύ των ζωτικών λειτουργιών των ιών και της άμυνας του ξενιστή. Η ταυτοποίηση παραγόντων του ξενιστή και του/των ρόλου/ων τους συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση της ρύθμισης πολύπλοκων μηχανισμών και την ανάπτυξη στρατηγικών αντιμετώπισής τους. Στην παρούσα εργασία ταυτοποιήθηκαν τρεις πρωτεΐνες τομάτας που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες του Pepino mosaic virus (PepMV) και διερευνήθηκε η εμπλοκή τους στην αναπαραγωγή του ιού και την καταστολή μηχανισμών άμυνας του φυτού. Από τα τρία Hsc70 γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, μόνο το Hsc70.3 αλληλεπιδρά εξειδικευμένα με την CP στο κυτόπλασμα, τον πυρήνα και ως μορφές έγκλειστων σωματιδίων. Σε PepMV-μολυσμένα φυτά τομάτας παρατηρήθηκε επαγωγή των επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης Hsc70, συσσώρευση και συν-τοποθέτησή της με σύμπλοκα ιικών σωματιδίων, καθώς και ανίχνευσή της στο κλάσμα καθαρισμένων ιοσωματίων. Τα δεδομένα αυτά υποδηλώνουν ένα ενεργό ρόλο της Hsc70 στη μόλυνση κατά την αλληλεπίδρασή της με την CP, μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται και στην μετακίνηση των potex-ιών. Η σίγηση του Hsp70 σε φυτά N. benthamiana είχε ως αποτέλεσμα την σχεδόν μη ανίχνευση του ιού στα διασυστηματικώς μολυσμένα φύλλα, ενώ ανάλογα ήταν και τα αποτελέσματα της προσέγγισης με κερκετίνη. Συνολικά τα αποτελέσματα αναδεικνύουν ένα σημαντικό ρόλο της Hsp70/CP αλληλεπίδρασης πιθανώς στη μετακίνηση του ιού. Μια δεύτερη αλληλεπίδραση που αναδείχτηκε ήταν μεταξύ της p25 και της καταλάσης. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός τους ανέδειξε την παρουσία τους στο κυτόπλασμα και τον πυρήνα, σε συμφωνία με τις θέσεις τροπισμού του συμπλόκου p25/καταλάση. Σε PepMV-μολυσμένα φυτά τομάτας δεν επάγεται mRNA και πρωτεΐνη της καταλάσης, αλλά αντ’ αυτού αυξάνεται σημαντικά η ενεργότητα του ενζύμου αντιστρόφως ανάλογα της παρουσίας Η2Ο2. Αναλύσεις έδειξαν ότι η επαγωγή της ενεργότητας του ενζύμου οφείλεται εξειδικευμένα στην αλληλεπίδρασή του με την p25 δρώντας προς όφελος του ιού ως μηχανισμός ρύθμισης του οξειδωτικού στρες αφού η σίγηση της καταλάσης σε φυτά N. benthamiana κατέδειξε ότι η υψηλής ενεργότητας καταλάση διασφαλίζει υψηλά τα επίπεδα του ιού. Σάρωση τεσσάρων πρωτεϊνών του PepMV ως προς το ρόλο τους στο μηχανισμό καταστολής της σίγησης του RNA έδειξαν ότι οι p25 και CP αποτελούν καταστολείς του φαινομένου με διαφορετική ενεργότητα και πιθανώς μηχανισμό δράσης, σε διαφορετικά στάδια του μηχανισμού της PTGS. Τα δεδομένα αυτά αναδεικνύουν για πρώτη φορά τη CP ενός potex-ιού ως καταστολέα της PTGS και ταυτόχρονα ένα διπλό ρόλο της p25 στην καταστολή δυο αμυντικών μηχανισμών του φυτού, του οξειδωτικού στρες και της σίγησης του RNA. Η πολυλειτουργική πρωτεΐνη p25 ταυτοποιήθηκε να αλληλεπιδρά επίσης με μια πρωτείνη τομάτας που κατέχει περιοχή θειορεδοξίνης και η οποία ομαδοποιείται φυλογενετικά με την ομάδα z πρωτεϊνών θειορεδοξίνης, μια κατηγορία πρωτεϊνών που σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες ως συνεργιστκός ρυθμιστής της λειτουργίας αντιοξειδωτικών ενζύμων. Τέλος, αλληλεπιδράσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ των p25 και CP επιβεβαιώνοντας προηγούμενες αναφορές και υποστηρίζοντας την ιδέα συντηρημένων αλληλεπιδράσεων εντός του γένους Potexvirus, ως δομικών στοιχείων του συμπλόκου μετακίνησης.