Διερεύνηση του ρόλου της πλειοτροπίνης και του υποδοχέα της με δράση φωσφατάσης τυροσίνης στη φυσιολογική αγγειογένεση και στη λειτουργία του καρδιαγγειακού συστήματος in vivo

Abstract

The formation of blood vessels during embryonic development occurs by two distinct morphogenetic mechanisms, vasculogenesis and angiogenesis. Vasculogenesis refers to the formation of a primary vascular network, while angiogenesis is the phenomenon under which new blood vessels are generated. Both processes are important for the development of a fully functional circulation system. Many factors play an important role in angiogenesis regulation and many pathophysiological processes are related to the disruption of this regulation, such as obesity, psoriasis, rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy and several types of cancer. Pleiotrophin, a heparin family factor, and its receptor RPTPβ/ζ (Receptor tyrosine phosphatase beta/ zeta) are molecules that are involved in angiogenesis regulation and are implicated into many pathological conditions (schizophrenia, Parkinson’s disease, tissue remodeling after ischemia and the development of atherotic plaques). Throughout the last years, several studies have highlighted the pivotal role of pleiotrophin and midkine (another heparin family gene, also ligand of RPTPβ/ζ) in cardiovascular diseases. However, the involvement of RPTPβ/ζ in cardiovascular development and disease has not been studied. In this study we focused on the functional analysis of PTN and RPTPβ/ζ gene in angiogenesis and cardiovascular development in vivo, using zebrafish as model. Zebrafish embryos are not dependent on a functional angiogenesis network during the first days of development, they are transparent and develop rapidly. We used the CRISPR/Cas9 genome editing system to generate zebrafish a ptn mutant zebrafish line and two mutant lines for the zebrafish duplicated RPTPβ/ζ genes, known as ptprz1a and ptprz1b. Phenotypic analysis of the ptn-/- mutant line and ptn morphants embryos confirmed the role of pleiotrophin in the regulation of in vivo angiogenesis. Respectively, the phenotypic screening of ptprz1a morphants embryos and the extensive cardiovascular analysis of ptptz1b-/- mutants successfully revealed the role of RPTPβ/ζ in the regulation of cardiac function in early cardiovascular development and zebrafish adulthood.

Ο σχηματισμός των αιμοφόρων αγγείων κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης πραγματοποιείται από δύο διακριτούς μορφογενετικούς μηχανισμούς, την αγγειακή μορφογένεση και την αγγειογένεση. Η αγγειακή μορφογένεση αναφέρεται στο σχηματισμό ενός πρωτογενούς αγγειακού δικτύου, ενώ η αγγειογένεση αποτελεί το φαινόμενο κάτω από το οποίο δημιουργούνται νέα αιμοφόρα αγγεία από τα προυπάρχοντα. Οι δύο αυτές διαδικασίες είναι εξίσου σημαντικές για την ανάπτυξη ενός πλήρως λειτουργικού συστήματος κυκλοφορίας. Η ρύθμιση της αγγειογένεσης ελέγχεται από ένα μεγάλο αριθμό παραγόντων και η διακοπή αυτής της ρύθμισης έχει συσχετιστεί με πολλές παθοφυσιολογικές διεργασίες όπως η παχυσαρκία, η ψωρίαση, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια και διάφοροι τύποι καρκίνου. Η πλειοτροπίνη, ένας παράγοντας της οικογένειας των ηπαρινών, και ο υποδοχέας της RPTPβ/ζ (υποδοχέας φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ) συμμετέχουν στη ρύθμιση της αγγειογένεσης και παράλληλα εμπλέκονται σε πολλές παθολογικές καταστάσεις (σχιζοφρένεια, νόσος του Πάρκινσον, αναδιαμόρφωση του ιστού μετά από ισχαιμία και ανάπτυξη αθηρωτικών πλακών). Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, αρκετές μελέτες έχουν επισημάνει τον κεντρικό ρόλο της πλειοτροπίνης και μεσοκίνης (ένα άλλο γονίδιο της οικογένειας μορίων με συγγένειας στην ηπαρίνη, επίσης προσδέτη του RPTPβ/ζ) σε καρδιαγγειακές παθήσεις. Ωστόσο, η συμμετοχή του RPTPβ/ζ στην καρδιαγγειακή ανάπτυξη και ασθένεια δεν έχει μελετηθεί. Σε αυτή τη μελέτη εστιάσαμε στη λειτουργική ανάλυση του ρόλου των γονιδίων της PTN και του RPTPβ/ζ στην αγγειογένεση και την καρδιαγγειακή ανάπτυξη in vivo, χρησιμοποιώντας ως μοντέλο το zebrafish. Χρησιμοποιήσαμε το σύστημα επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR/Cas9 ώστε να δημιουργήσουμε μια μεταλλαγμένη σειρά zebrafish για το γονίδιο ptn και δύο μεταλλαγμένες σειρές για το διπλό γονίδιο του RPTPβ/ζ, όπου στο zebrafish είναι γνωστά ως ptprz1a και ptprz1b. Η φαινοτυπική ανάλυση της μεταλλαγμένης οικογένειας ptn-/- , αλλά και των εμβρύων που εγχύθηκαν με συνθετικό μορφολίνο για το γονίδιο ptn επιβεβαίωσαν το ρόλο της πλειοτροπίνης στη ρύθμιση της in vivo αγγειογένεσης. Αντίστοιχα, η φαινοτυπική μελέτη των εμβρύων που εγχύθηκαν με μορφολίνο για το γονίδιο ptprz1a και η εκτενής καρδιαγγειακή ανάλυση των μεταλλαγμένων ptptz1b-/- ατόμων ανέδειξαν με επιτυχία τον ρόλο του RPTPζ/β στη ρύθμιση της καρδιακής λειτουργίας του zebrafish κατά την πρώιμη καρδιαγγειακή ανάπτυξη και την ενήλικη ζωή.