Έκφραση των κυτταροκινών IL-1β,IL-2, IL-12p40, IL-23p19, TNF-a και CCL-28 στον βλεννογόνο του εντέρου και τη βλέννα και συσχέτισή τους με τα κλινικά, ενδοσκοπικά και ιστοπαθολογικά ευρήματα σε σκύλους με ιδιοπαθή φλεγμονώδη νόσο του παχέος εντέρου

Abstract

Canine inflammatory bowel disease (IBD) is a group of chronic or recurrent gastrointestinal (GI) disorders with persistent or relapsing clinical signs and histopathologic evidence of inflammation in the small and/or large intestinal mucosa. The exact etiopathogenesis of IBD is still unknown. However, genetic and environmental factors, intestinal microbiota and dysregulated host immune response may all contribute to the pathogenesis of the disease. The aim of the present study was to investigate the colonic mucosal and cytobrush samples (colonic mucus) relative mRNA expression of interleukin (IL)-1β, IL-2, IL-12p40, IL-23p19, TNF-α and C‐C motif chemokine ligand (CCL28), as well as the correlations of mRNA expression of these cytokines in the colonic mucosa with the corresponding in the colonic cytobrush (mucus) samples of dogs with large intestinal IBD. Furthermore, the correlation of colonic mucosa cytokines mRNA expression with the clinical and endoscopic activity, as well as with histopathologic lesions of the dogs with large intestinal IBD was also evaluated.For this purpose, 26 dogs with IBD presented or referred to Companion Animal Clinic, School of Veterinary Medicine, Aristotle University of Thessaloniki and 9 healthy dogs (controls) were included to the study. All dog owners provided informed written consent for enrollment of their dog into the study. The experimental protocol was reviewed and approved by the ethics committee of the School of Veterinary Medicine, Aristotle University of Thessaloniki (58/ 29-9-2015). All dogs underwent physical examination and diagnostic evaluation to exclude other known causes of large intestinal diarrhea, i.e. complete blood count, routine serum biochemistry, parasitological and cytological examination of feces and detection of Giardia-specific cyst wall antigen in feces. Clinical disease activity was recorded for all dogs using the Canine Chronic Enteropathy Clinical Activity Index (CCECAI). For statistical purposes, dogs with clinically insignificant, mild and moderate CCECAI scores (i.e., 0-8) were further categorized as the low CCECAI group and dogs with severe and very severe CCECAI scores (i.e., ≥9) as the high CCECAI group. Colonoscopy followed by colonic mucosal biopsy specimens and cytobrush samples (mucus) collection for cytokines mRNA expression analysis was performed in all dogs. Biopsy specimens were also examined histologically and graded according to the World Small Animal Veterinary Association (WSAVA) GI histopathologic guidelines. In order to analyze and quantify the expression of mRNA of IL-1β, IL-2, IL-12p40, IL-23p19, TNF-α and CCL28 total RNA was isolated from colonic mucosa and mucus samples using a highly sensitive real-time PCR methodology. Among dogs with IBD, 9/26 (35%) showed mild CCECAI score, 10/26 (38%) moderate and 7/26 (27%) severe. Median endoscopy score of dogs with IBD was 4. All 26 dogs with IBD included in this study had evidence of primarily lymphoplasmacytic infiltration. The mRNA expression of IL-1β, IL-23p19 and CCL28 mRNA expression were statistically significantly increased in the mucosa of dogs with large bowel IBD compared to controls, findings that leads to the conclusion that these cytokines may play a role in canine large intestinal IBD pathogenesis. Although the mRNA expression of IL-2, IL-12p40 and TNF-α was increased, there was no statistically significant difference between the dogs with large intestinal IBD and controls. Furthermore, there was no significantly different relative mRNA expression of IL-1β, IL-2, IL-12p40, IL-23p19, TNF-α and CCL28 in the colonic mucosa between IBD dogs with low or high CCECAI score. The expression did not correlate with clinical disease and/or endoscopic activity score. The cytokines expression in the colonic mucus did not reveal useful information regarding canine IBD. Finally, clinical disease activity (CCECAI) correlated positively with endoscopic activity score, fibrosis and atrophy in dogs with large intestinal IBD.

Η ιδιοπαθής φλεγμονώδης νόσος του εντέρου (ΙΦΝΕ) του σκύλου αποτελεί ένα σύνολο χρόνιων νοσημάτων του εντερικού σωλήνα αδιευκρίνιστης αιτιολογίας και μπορεί να αφορά το λεπτό ή/και το παχύ έντερο (ιδιοπαθής φλεγμονώδης νόσος του παχέος εντέρου, ΙΦΝΠΕ). Η ΙΦΝΕ/ΙΦΝΠΕ αποτελεί σταθερά τις τελευταίες δεκαετίες το κύριο ερευνητικό ενδιαφέρον της Γαστρεντερολογίας των Ζώων Συντροφιάς, παρ’ όλα αυτά η αιτιοπαθογένεια του νοσήματος θεωρείται ακόμα και σήμερα εν πολλοίς αδιευκρίνιστη. Οι περισσότερες πληροφορίες προέρχονται από μελέτες που αφορούν το λεπτό έντερο, ενώ αυτές που αφορούν το παχύ είναι περιορισμένες. Συνδυάζοντας την υπάρχουσα γνώση για την ΙΦΝΕ/ΙΦΝΠΕ του σκύλου με εκείνη του ανθρώπου, αλλά και με πληροφορίες που απορρέουν από μελέτες σε ποντίκια, προκύπτει πως η ΙΦΝΕ/ΙΦΝΠΕ αποτελεί μια πολυπαραγοντική παθολογική κατάσταση στην οποία κεντρικό ρόλο φαίνεται να παίζει η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ της φυσικής και της επίκτητης ανοσίας, καθώς και της εντερικής μικροχλωρίδας, ενώ γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες και το ανοσοποιητικό σύστημα του βλεννογόνου του εντέρου φαίνεται να συμμετέχουν στην παθογένεια του νοσήματος. Διαχρονικά έχουν γίνει προσπάθειες προκειμένου να αποκωδικοποιηθεί η φλεγμονική διεργασία στην ΙΦΝΠΕ του σκύλου, αν και είναι λιγότερες από εκείνες που στόχευαν στην ΙΦΝΕ του λεπτού εντέρου. Αρχικά μελετήθηκε ο τύπος των κυττάρων που διηθεί τον βλεννογόνο του παχέος εντέρου, ενώ αργότερα μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών σ’ αυτόν χρησιμοποιώντας τόσο ημιποσοτικές όσο και ποσοτικές μεθόδους. Αν και οι παραπάνω μελέτες είναι περιορισμένες και αφορούν μικρό αριθμό σκύλων φαίνεται να μην υπάρχει ξεκάθαρη Th1 ή Th2 ανοσολογική απάντηση. Κύριος στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο προσδιορισμός της σχετικής έκφρασης των IL-1β, IL-2, IL-12p40, IL-23p19, TNF-α και CCL28 στον βλεννογόνο και στη βλέννα του παχέος εντέρου σκύλων με ΙΦΝΠE καθώς και η διερεύνηση της συσχέτισης της σχετικής έκφρασης των κυτταροκινών αυτών στον βλεννογόνο του παχέος εντέρου με την κλινική και ενδοσκοπική εικόνα, καθώς και τις ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις του βλεννογόνου του παχέος εντέρου σκύλων με ΙΦΝΠE. Στη μελέτη μας συμμετείχαν συνολικά 35 σκύλοι, 26 με ΙΦΝΠΕ και 9 μάρτυρες. Οι ιδιοκτήτες των σκύλων με ΙΦΝΠΕ και των μαρτύρων ενημερώνονταν για τη μελέτη και έδιναν ενυπόγραφη συγκατάθεση για τη συμμετοχή τους σ’ αυτήν (Έγκριση κλινικής μελέτης: Συνεδρίαση της Γενικής Συνέλευσης του Τμήματος Κτηνιατρικής 58/ 29-9-2015). Σε όλους τους σκύλους, κατά την προσκόμισή τους στην Κλινική Ζώων Συντροφιάς, του Τμήματος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. γινόταν λήψη του ιστορικού, κλινική εξέταση, γενική εξέταση αίματος, βιοχημικές εξετάσεις στον ορό του αίματος, ανάλυση ούρου και παρασιτολογικές εξετάσεις κοπράνων. Ως εκ τούτου, οι σκύλοι με ΙΦΝΠΕ βαθμολογούνταν και κατατάσσονταν σύμφωνα με τον δείκτη εκτίμησης της κλινικής δραστηριότητας των χρόνιων εντεροπαθειών του σκύλου (Canine Chronic Enteropathy Activity Index, CCECAI). Στη συνέχεια σε όλους τους σκύλους γινόταν κολοσκόπηση, κατά την οποία αξιολογούνταν και καταγράφονταν οι αλλοιώσεις του βλεννογόνου του παχέος εντέρου (αθροιστική ενδοσκοπική αξιολόγηση) και λαμβάνονταν ενδοσκοπικές βιοψίες και βλέννα. Στα ιστοτεμάχια και τη βλέννα προσδιοριζόταν η σχετική έκφραση των IL-1β, IL-2, IL-12p40, IL-23p19, TNF-α και CCL28 με την εφαρμογή μοριακών μεθόδων (real time RT-PCR), και τα ιστοτεμάχια εξετάζονταν επιπλέον ιστοπαθολογικά για να τεθεί η οριστική διάγνωση του νοσήματος. Η διάγνωση και η βαθμολόγηση των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων γινόταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του World Small Animal Veterinary Association (WSAVA) International GI Standardization Group. Σύμφωνα με τον CCECAI, 9/26 (34,6%) σκύλοι με ΙΦΝΠΕ εμφάνιζαν ήπιας σοβαρότητας νόσο, 10/26 (38,5%) μέτριας και 7/26 (26,9%) σοβαρή νόσο. Για στατιστικούς και κλινικούς λόγους, οι σκύλοι που εμφάνιζαν ήπια και μέτρια νόσο συνενώθηκαν σε μία ομάδα (ήπιο/μέτριο CCECAI) (19/26, 73,07%), ενώ οι σκύλοι με σοβαρή νόσο παρέμειναν στην ίδια ομάδα (σοβαρό CCECAI) (7/26, 26,92%). Κατά την ενδοσκόπηση διαπιστώθηκε ότι οι 22/26 (84.6%) σκύλοι παρουσίαζαν ευθρυπτότητα του βλεννογόνου, ενώ οι 12/26 (46.2%) και οι 10/26 (38.5%) εμφάνιζαν ήπιου και σοβαρού βαθμού αιμορραγία κατά την επαφή του ενδοσκοπίου με αυτόν, αντίστοιχα. Επιπλέον, παρουσίαζαν ήπιου ή μέτριου βαθμού μεταβολή της υφής του βλεννογόνου του παχέος εντέρου (κοκκιώδης όψη) οι 13/26 (50%) σκύλοι και οι 3/26 (11.5%) σοβαρού βαθμού. Τέλος, η πλειονότητα των σκύλων (25/26, 96.2%) παρουσίαζε διαβρώσεις στον βλεννογόνο του παχέος εντέρου. Όλοι οι σκύλοι με ΙΦΝΠΕ παρουσίαζαν διαφόρου βαθμού αλλοιώσεις στην αρχιτεκτονική δομή και διήθηση του χορίου του βλεννογόνου από φλεγμονικά κύτταρα, με τα λεμφοκύτταρα και τα πλασματοκύτταρα να απαντώνται συχνότερα. Στον βλεννογόνο του παχέος εντέρου σκύλων με ΙΦΝΠΕ παρατηρήθηκε αύξηση της σχετική έκφρασης του mRNA των IL-1β, IL-23p19 και CCL28 σε σχέση με αυτή των μαρτύρων, ενώ δεν διαπιστώθηκε διαφορά στην έκφρασή τους μεταξύ των σκύλων με ήπιο/μέτριο και σοβαρό CCECAI. Αντίθετα, η σχετική έκφραση των IL-2, IL-12p40 και TNF-α των σκύλων με ΙΦΝΠΕ δεν διέφερε συγκριτικά με τους μάρτυρες. Στη βλέννα του παχέος εντέρου των σκύλων με ΙΦΝΠΕ δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην σχετική έκφραση όλων των κυτταροκινών σε σχέση με τους μάρτυρες, αλλά ούτε και συσχέτιση της σχετικής έκφρασής τους στον βλεννογόνο του παχέος εντέρου με την αντίστοιχη έκφραση τους στη βλέννα του παχέος εντέρου. Ακόμα, στους σκύλους με ΙΦΝΠΕ δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση της σχετικής έκφρασης των IL-1β, IL-2, IL-12p40, IL-23p19, TNF-α και CCL28 στον βλεννογόνο του παχέος εντέρου με τον CCECAI, αλλά ούτε και με την ενδοσκοπική αξιολόγηση των αλλοιώσεων. Τέλος, στην ΙΦΝΠΕ του σκύλου παρατηρήθηκε μέτριου βαθμού και θετική συσχέτιση της ενδοσκοπικής αξιολόγησης των αλλοιώσεων με τον CCECAI, αλλά όχι με τη βαθμολόγηση των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων του βλεννογόνου του παχέος εντέρου.