Comparative study of the efficacy and safety between aminosidine (paromomycin) and meglumine antimonate for the treatment of canine leishmaniosis due to Leishmania infantum

Abstract

Canine leishmaniosis is a zoonotic disease caused by the protozoan L. infantum (syn: L.chagasi) with a high prevalence of infection in many countries, including Greece. Current treatment recommendations for dogs without advanced kidney disease include the administration of meglumine antimoniate or miltefosine for 4 weeks along with allopurinol for at least 12 months. These combination treatments are relatively safe and lead to significant clinical and clinicopathological improvement, reduction of parasitic load and of Lesihmania-specific antibodies, and are accompanied by low relapse rates. Protozoan resistance to first-line drugs is a well-known problem in human medicine. In CanL, similar reports of drug resistance, although sparse, appear more and more commonly. Drug pressure (e.g. repeated administration of meglumine antimoniate and long-term allopurinol administration) are documented causes for the development of resistance. Due to the frequency of CanL in endemic areas and the zoonotic potential, investigations on alternative treatment options are urgently needed. Aminosidine (paromomycin) is an aminoglycoside antibiotic with leihmaniocidal properties that has been studied and used mainly in human leishmanioses. The efficacy and safety of aminosidine as monotherapy of CanL has been previously assessed in a small number of clinical trials. Despite some notable differences among the results of these studies, a good short-term clinical and clinicopathological response has been documented but it is accompanied by dose-related severe side effects and by a high relapse rate after treatment discontinuation. Recently, aminosidine administered at an optimized dose regimen (15 mg/kg, once daily, subcutaneously), resulted in effective plasma concentrations, good short-term clinical and clinicopathological improvement and reduction of parasitic load. To the best of our knowledge there are no published studies evaluating the efficacy of aminosidine-allopurinol combination for the treatment of CanL. However, similarly to the first-line drugs (meglumine antimoniate and miltefosine) the combination of aminosidine with allopurinol is probably mandatory to improve efficacy and, mainly, to avoid relapses. The aim of this randomized, blinded, controlled study was to compare the efficacy and safety of aminosidine-allopurinol combination with that of meglumine antimoniate-allopurinol, in terms of improvement of clinical signs and clinicopathological abnormalities, relapse rate, parasitic load reduction, evolution of Leishmania-specific humoral and cell mediated immune responses and side effects. Forty client-owned dogs with at least one clinical sign of CanL, without evidence of stage III or IV chronic kidney disease were randomly assigned to group A [n=20; aminosidine (15 mg/kg, subcutaneously, once daily for 28 days) and allopurinol (10 mg/kg, per os, twice daily for 6 months] or group B [n=20; meglumine antimoniate (100 mg/kg subcutaneously, once daily for 28 days) and allopurinol (same dose as in above)]. At enrollment (time 1) the dogs were physically examined and biological material were collected (blood, urine, lymph node and bone marrow aspirates). Re-examinations were scheduled after 15 (time 2), 30 (time 3), 60 (time 4) and 180 days (time 5). The examinations included: a) physical examination and scoring of the extent and severity all CanL-associated clinical signs (times 1-5); b) complete blood count including a manual differential count (times 1-5); c) complete serum biochemistry including C-reactive protein and c-cystatin (times 1-5); d) complete urinalysis including UPC (times 1-5) and urine culture (time 1); e) lymph node and bone marrow microscopy for measurement of parasitic density (times 1 and 3-5); f) IFAT (times 1 and 3-5); g) real-time PCR in bone marrow samples for measurement of parasitic density (times 1 and 3-5); h) LST (times 1 and 3-5); i) BAER testing (times 1-4). All examinations were conducted blindly regarding the group of each dog. During the first month (injectable treatment) all dogs were hospitalized and daily physical examinations were conducted by a non-blinded investigator who was also responsible for randomization and treatment administration. Primary outcome measures were the proportions of dogs that: a) experienced treatment-related side effects; b) were cured (no clinical signs, anemia, hypoalbuminemia, hyperglobulinemia or low AG ratio); and c) were parasitologically negative (lymph node and bone marrow microscopy and bone marrow RT-PCR) at the end of the trial. Secondary outcome measures were the proportions of dogs that a) were clinically cured (no clinical signs, irrespectively of the clinicopathological abnormalities); b) had no anemia, hypoalbuminemia, hyperglobulinemia, low AG ratio or increased C-reactive protein concentration; c) were seronegative; and d) were LST positive. There were no differences between groups for the primary outcome measures (treatment related side effects: p=1; cure: p=0.074; negative parasitological examinations: p=0.485). However, there were differences in some secondary outcome measures favor of group B: prevalence of clinical cure (p=0.044), hyperglobulinemia (p=0.008) and prevalence of seronegative dogs (p=0.02). On the other hand, the prevalence of anemia (p=0.189), hypoalbuminemia (p=1), decreased AG ratio (p=0.09), increased C-reactive protein concentration (p=0.074) and LST positivity (p=0.097). The aminosidine-allopurinol combination resulted in a significant improvement of clinical signs and clinicopathological abnormalities, a reduction of antibody titers and parasitic load and an increased prevalence of positive LST. The time and the probability to achieve these goals of treatment were not generally different between the groups.No significant nephrotoxic or ototoxic adverse events were observed in the dogs of the trial. Increases of creatinine concentration >0.3 mg/dl were recorded in both groups at a similar frequency.Based on these results aminosidine-allopurinol concentration should be considered a safe and effective treatment for CanL. Due to some differences in secondary outcome measures, it cannot be considered as equally effective with the meglumine antimoniate-allopurinol combination and, thus, it is proposed a second-line drug combination for the treatment of CanL.

Οι λεϊσμανιώσεις του ανθρώπου και του σκύλου είναι νοσήματα που οφείλονται στα πρωτόζωα του γένους Leishmania και είναι ενδημικές σε πολλές χώρες του κόσμου, μεταξύ των οποίων και η Ελλάδα. Στο σκύλο, η μόλυνση από L. inafntum μπορεί να προκαλέσει συστηματικό νόσημα που θα οδηγήσει στο θάνατο αν δεν αντιμετωπιστεί έγκαιρα. Οι πρώτης γραμμής θεραπευτικές επιλογές είναι οι συνδυασμοί της αντιμονιακής μεγλουμίνης ή της μιλτεφοσίνης για 4 εβδομάδες με την αλλοπουρινόλη για τουλάχιστον 12 μήνες. Σε μεγάλο αριθμό μελετών έχει διαπιστωθεί ότι με τα παραπάνω σχήματα επιτυγχάνεται συνήθως κλινική ίαση, βελτιώνονται ή εξαφανίζονται οι εργαστηριακές διαταραχές, μεταβάλλεται προς την κατεύθυνση της κυτταρικής ανοσίας η αντίδραση του σκύλου στο πρωτόζωο και μειώνεται το παρασιτικό φορτίο, ενώ οι παρενέργειες δεν είναι ιδιαίτερα συχνές. Επιπλέον, η μακροχρόνια (συχνά εφ’ όρου ζωής) χορήγηση της αλλοπουρινόλης μειώνει σημαντικά τη συχνότητα των υποτροπών.Ωστόσο, τις τελευταίες δεκαετίες, διαπιστώνεται, σε πολλές περιοχές του κόσμου, μια δραματική αύξηση της ανθεκτικότητας των Leishmania spp. του ανθρώπου στα φάρμακα πρώτης επιλογής. Παράλληλα, τα τελευταία χρόνια πληθαίνουν οι αναφορές απομόνωσης ανθεκτικών στελεχών της L. inafntum από σκύλους με λεϊσμανίωση. Το πρόβλημα αφορά κυρίως την αντιμονιακή μεγλουμίνη και την αλλοπουρινόλη. Μάλιστα, οι επαναλαμβανόμενοι θεραπευτικοί «κύκλοι» με την πρώτη και η μακροχρόνια χορήγηση της δεύτερης αποτελούν πλέον γνωστά αίτια εμφάνισης ανθεκτικών στελεχών. Δεδομένου ότι η λεϊσμανίωση του σκύλου είναι πολύ συχνή στην κλινική πράξη και ότι ο σκύλος αποτελεί δεξαμενή του παρασίτου που μπορεί να μολύνει τον άνθρωπο, γίνεται επιτακτική η έρευνα για εναλλακτικές θεραπευτικές επιλογές, κατά προτίμηση με δραστικές ουσίες που δε χρησιμοποιούνται για την αντίστοιχη νόσο του ανθρώπου. Η αμινοσιδίνη (παρομομυκίνη) είναι αμινογλυκοσιδικό αντιβιοτικό δραστικό έναντι της L.infantum που έχει χρησιμοποιηθεί κυρίως για τη θεραπεία των λεϊσμανιώσεων του ανθρώπου. Η αποτελεσματικότητα και η ασφάλειά της στη λεϊσμανίωση του σκύλου έχει διερευνηθεί σε περιορισμένο αριθμό μελετών, οι οποίες, παρά τις μεγάλες διαφορές που έχουν μεταξύ τους σε ότι αφορά το σχεδιασμό, καταλήγουν ότι βελτιώνει την κλινική εικόνα και τις εργαστηριακές διαταραχές αλλά παράλληλα προκαλεί σοβαρές παρενέργειες ενώ οι υποτροπές μετά τη διακοπή της είναι πολύ συχνές. Πρόσφατα η χορήγηση της αμινοσιδίνης στη δόση των 15 mg/kg σωματικού βάρους, υποδόρια, κάθε 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα την επίτευξη θεραπευτικών συγκεντρώσεων στο πλάσμα του αίματος, τη σημαντική υποχώρηση των συμπτωμάτων και των εργαστηριακών διαταραχών και τη μείωση του παρασιτικού φορτίου. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν δημοσιευμένες μελέτες που να αξιολογούν την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια της ταυτόχρονης χορήγησης αμινοσιδίνης και αλλοπουρινόλης σε σκύλους με λεϊσμανίωση. Ωστόσο και οι δύο δραστικές ουσίες πρώτης επιλογής για τη θεραπεία της λεϊσμανίωσης του σκύλου (αντιμονιακή μεγλουμίνη, μιλτεφοσίνη) χορηγούνται απαραίτητα μαζί με την αλλοπουρινόλη, ώστε να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα και κυρίως να μειωθεί η συχνότητα των υποτροπών. Στόχος αυτής της τυφλής, τυχαιοποιημένης και με θετικό μάρτυρα μελέτης ήταν η σύγκριση του συνδυασμού αμινοσιδίνης-αλλοπουρινόλης με το συνδυασμό αντιμονιακής μεγλουμίνης-αλλοπουρινόλης, σε ότι αφορά την ασφάλεια, την κλινική αποτελεσματικότητα, τη συχνότητα των υποτροπών, τη βελτίωση των εργαστηριακών διαταραχών, τη μείωση του παρασιτικού φορτίου και τη μεταβολή της ειδικής έναντι του παρασίτου χυμικής και κυτταρικής ανοσίας. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 40 ιδιόκτητοι σκύλοι με ένα ή περισσότερα συμπτώματα λεϊσμανίωσης χωρίς νεφρική νόσο σταδίου III-IV, που τυχαιοποιήθηκαν στην ομάδα Α [n=20, αμινοσιδίνη (15 mg/kg, υποδόρια, κάθε 24 ώρες για 28 ημέρες) και αλλοπουρινόλη (10 mg/kg, από το στόμα, κάθε 12 ώρες για 6 μήνες)] και στην ομάδα Β [n=20, αντιμονιακή μεγλουμίνη (100 mg/kg, υποδόρια, κάθε 24 ώρες για 28 ημέρες) και αλλοπουρινόλη (ίδιο δοσολογικό σχήμα με την ομάδα Α)]. Μετά την ένταξη τους στη μελέτη (χρόνος 1) εξετάζονταν κλινικά και λαμβάνονταν τα βιολογικά υλικά (αίμα, ούρα, υλικό παρακέντησης λεμφογαγγλίου και μυελού των οστών). Οι επανεξετάσεις ήταν προγραμματισμένες στις 15 (χρόνος 2), τις 30 (χρόνος 3), τις 60 (χρόνος 4) και τις 180 ημέρες (χρόνος 5) από την έναρξη της θεραπείας. Οι εξετάσεις που πραγματοποιήθηκαν ήταν οι: α) κλινική εξέταση με βαθμολόγηση της παρουσίας και της έντασης των συμπτωμάτων (χρόνοι 1-5), β) γενική εξέταση αίματος και λευκοκυτταρικός τύπος (χρόνοι 1-5), γ) πλήρης βιοχημική εξέταση στον ορό του αίματος (χρόνοι 1-5), δ) μέτρηση της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης και της c-συστατίνης στον ορό του αίματος (χρόνοι 1-5), ε) γενική ανάλυση ούρων με μέτρηση του UPC (χρόνοι 1-5) και καλλιέργεια για αερόβιους μικροοργανισμούς (χρόνος 1), στ) μικροσκοπική εξέταση και καταμέτρηση του παρασιτικού φορτίου σε επιχρίσματα λεμφογαγγλίου και μυελού των οστών (χρόνοι 1 και 3-5), ζ) μέτρηση του τίτλου των ειδικών κατά της Leishmania αντισωμάτων με τη μέθοδο IFAT (χρόνοι 1 και 3-5) η) RT-PCR σε δείγμα μυελού των οστών για τη μέτρηση του παρασιτικού φορτίου (χρόνοι 1 και 3-5) θ) LST για τον έλεγχο της ειδικής έναντι του παρασίτου κυτταρικής ανοσίας (χρόνοι 1 και 3-5) και ι) BAER για τον έλεγχο της ακοής (χρόνοι 1-4). Όλες οι παραπάνω εξετάσεις πραγματοποιήθηκαν χωρίς να είναι γνωστή η ομάδα του κάθε σκύλου. Στη διάρκεια του πρώτων 4 εβδομάδων (ενέσιμη θεραπεία) όλα τα ζώα νοσηλεύτηκαν στις εγκαταστάσεις της Παθολογικής Κλινικής του Τμήματος Κτηνιατρικής του Π.Θ. και ελέγχονταν κλινικά σε καθημερινή καθημερινά από ερευνητή που γνώριζε την ομάδα του κάθε σκύλου και ήταν υπεύθυνος για την τυχαιοποίηση και τη χορήγηση της θεραπείας. Τα πρωτογενή μέτρα έκβασης της μελέτης περιλαμβάνονταν το ποσοστό των σκύλων που: α) εμφάνισε παρενέργειες από τα φάρμακα β) ιάθηκε (απουσία συμπτωμάτων, αναιμίας, υπολευκωματιναιμίας, υπερσφαιριναιμίας και μειωμένου λόγου AG στο τέλος της μελέτης, και γ) ήταν παρασιτολογικά αρνητικοί στη μικροσκοπική εξέταση των λεμφογαγγλίων και του μυελού των οστών και στη RT-PCR στο τέλος της μελέτης. Στα δευτερογενή μέτρα έκβασης περιλαμβάνονται το ποσοστό των σκύλων που: α) εμφάνισε κλινική ίαση (απουσία συμπτωμάτων), β) δεν είχε αναιμία, υπολευκωματιναιμία, υπερσφαιριναιμία, μειωμένο λόγο AG και αυξημένη C-αντιδρώσα πρωτεΐνη, γ) ήταν ορολογικά αρνητικό και δ) εμφάνισε θετική LST στο τέλος της μελέτης. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων για τα πρωτογενή μέτρα έκβασης, δηλαδή το ποσοστό των σκύλων που εμφάνισε παρενέργειες ή πέθανε (p=1), που ιάθηκε (p=0,074) ή που ήταν παρασιτολογικά αρνητικό (p=0,485). Ωστόσο υπήρχαν μερικές διαφορές υπέρ της ομάδας Β σε ορισμένα δευτερογενή μέτρα έκβασης και συγκεκριμένα τη συχνότητα της κλινικής ίασης (p=0,044), της υπερσφαιριναιμίας (p=0,008) και του αρνητικού αποτελέσματος της ορολογικής εξέτασης (p=0,02). Αντίθετα δεν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των ομάδων αναφορικά με τη συχνότητα της αναιμίας (p=0,189), της υπολευκωματιναιμίας (p=1), του μειωμένου λόγου AG (p=0,09), της αυξημένης συγκέντρωσης C-αντιδρώσας πρωτεΐνης (p=0,074) και της θετικής LST (p=0,097). Η χορήγηση του συνδυασμού αμινοσιδίνης και αλλοπουρινόλης είχε ως αποτέλεσμα της σημαντική μείωση της συχνότητας και της έντασης των περισσοτέρων συμπτωμάτων και εργαστηριακών διαταραχών, τη μείωση του παρασιτικού φορτίου και του τίτλου των αντισωμάτων και την αύξηση του αριθμού των σκύλων με θετική δοκιμή LST. Ο χρόνος για να επιτευχθούν οι παραπάνω στόχοι της θεραπείας και ο ρυθμός βελτίωσης αυτών των παραμέτρων κατά κανόνα δεν διέφεραν μεταξύ των δύο ομάδων. Σε κανένα σκύλο της μελέτης δεν παρατηρήθηκε σημαντικές παρενέργειες σε ότι αφορά τη νεφρική λειτουργία ή συμπτώματα ωτοτοξικότητας (μείωση ακουστικής ικανότητας, περιφερικό αιθουσαίο σύνδρομο). Μικρές αυξήσεις της συγκέντρωσης της κρεατινίνης (> 0,3 mg/dl) παρατηρήθηκαν και στις δύο ομάδες χωρίς σημαντικές διαφορές μεταξύ τους. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, ο παραπάνω συνδυασμός αμινοσιδίνης-αλλοπουρινόλης είναι ασφαλής και αποτελεσματικός για τη θεραπεία της λεϊσμανίωσης του σκύλου. Οι διαφορές σε μερικά από τα δευτερογενή μέτρα έκβασης δεν επιτρέπουν να χαρακτηριστεί ισοδύναμος με το συνδυασμό αντιμονιακής μεγλουμίνης-αλλοπουρινόλης και κατά συνέπεια προτείνεται ως αγωγή δεύτερης επιλογής για τη θεραπεία της λεϊσμανίωσης του σκύλου