Μελέτη της συχνότητας ανίχνευσης του πρωτόζωου Leishmania infantum και των επιπτώσεών του στον πνεύμονα του σκύλου

Abstract

Canine leishmaniosis (CanL) is a multisystemic, vector-borne zoonosis which in Europe is predominantly caused by the parasite Leishmania infantum. Clinical manifestations of the disease include weight loss, lethargy, generalized lymph node enlargement, skin and ocular lesions. Pulmonary involvement occurs in canine leishmaniosis, yet respiratory signs are considered rare. Histopathological pulmonary alterations include chronic diffuse interstitial pneumonia and are commonly identified in specimens obtained during necropsy.The aim of the present study was to investigate the presence of L. infantum and its consequences, in the lungs of dogs with naturally occurring CanL, using bronchoscopy, bronchoalveolar lavage fluid, bronchial mucosa biopsies and fine needle aspiration of the lungs. For the purpose of the study, 31 dogs with naturally occurring CanL, presented to the Companion Animal Clinic, School of Veterinary Medicine, Aristotle University of Thessalonikiand fullflling the inclusion criteria were enrolled. All dog owners were informed about the study protocol and written consent was provided prior to the enrollment. The study protocol was approved by the ethics committee of the School of Veterinary Medicine, Aristotle University of Thessaloniki (56/ 24-06-2015). Diagnostic approach included a thorough history, physical examination, complete blood count, routine serum biochemistry, urinalysis,cytological examination of lymph node and bone marrow smears and serum immunofluorescence antibody testing. Dogs with concurrent diseases and azotemia were excluded. Cough was detected in 5/31 (16.1%) dogs. Radiography of the thorax revealed bronchial and interstitial patterns in 12/31 (38.7%) dogs, while bronchoscopic lesions including hyperemia, edema, mucosal granularity and secretions, were observed in 19/31(61.3%) dogs. Cytological examination of bronchoalveolar lavage fluid revealed histiocytic inflammation in 14/31 (45.2%) dogs, while the parasite was identified in one (3.2%) dog. Histopathological examination of bronchial mucosa specimens revealed inflammatory cell infiltration in 24/31 (77.4%) dogs, while thickening of the inter-alveolar septa was seen in four dogs where alveoli were also collected. No Leishmania amastigotes were observed. Antigenic parasitic loads were detected in bronchial mucosa specimens and bronchoalveolar lavage fluid by real-time polymerase chain reaction (qPCR), immunohistochemistry and immunocytochemistry in the vast majority of the dogs examined. Lesions observed upon radiography of the thorax, bronchoscopy, cytological examination of the bronchoalveolar lavage fluid and histopathology and the presence of cough were not significantly associated with the parasitic load detected by qPCR or the clinical severity of leishmaniosis. Cough was significantly associated with more severe bronchoscopic lesions. Conclusively, lungs are affected by L. infantum during naturally occurring CanL, while clinical manifestations from lower respiratory system are rare. Bronchoscopy is a safe diagnostic procedure that allows visual inspection and sampling of the lesions of the bronchial mucosa. Lesions upon bronchoscopy and histopathology are mild and are not significantly correlated with the severity of CanL or with the parasitic load detected by qPCR in various tissues. Immunohistochemistry and immunocytochemistry yield the highest rate of identifying the parasite in the lung and bronchoalveolar lavage fluid.

Η λεϊσμανίωση του σκύλου αποτελεί ένα πολυσυστηματικό νόσημα που, στην Ευρώπη, οφείλεται κατά κύριο λόγο στο παράσιτο L. infantum και μεταδίδεται κυρίως με τα νύγματα μολυσμένων αρθροπόδων του γένους Phlebotomus που αποτελούν τους ενδιάμεσους ξενιστές. Το παράσιτο προσβάλει και τον άνθρωπο, ωστόσο ο σκύλος θεωρείται η σημαντικότερη δεξαμενή του. Η κλινική εκδήλωση του νοσήματος παρουσιάζει μεγάλη ποικιλομορφία, καθώς οι μολυσμένοι σκύλοι μπορεί να παραμείνουν ασυμπτωματικοί για μήνες έως χρόνια, να εκδηλώσουν ήπια ή σοβαρά συμπτώματα, μέχρι και θάνατο συνήθως λόγω νεφρικής νόσου τελικού σταδίου. Τα συχνότερα συμπτώματα είναι η λεμφογαγγλιομεγαλία, η κακή θρεπτική κατάσταση, η επίσταξη, οι εκδηλώσεις από το δέρμα και τους οφθαλμούς, ενώ οι συχνότερες εργαστηριακές διαταραχές είναι η υπερπρωτεϊναιμία, η υπολευκωματιναιμία, η υπερσφαιριναιμία, η αναιμία, η θρομβοκυτταροπενία και η αζωθαιμία. Η διάγνωση του νοσήματος στηρίζεται στον συνδυασμό της συμβατής κλινικής εικόνας με τα αποτελέσματα των ορολογικών εξετάσεων στον ορό του αίματος και των κυτταρολογικών εξετάσεων από δείγματα λεμφογαγγλίων ή/και μυελού των οστών. Σπανιότερα χρησιμοποιούνται οι μοριακές μέθοδοι (μέθοδος της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο, real-timepolymerase chain reaction, qPCR), καθώς και οι ειδικές ανοσολογικές (ανοσοϊστοχημεία και ανοσοκυτταροχημεία), σε διάφορα βιολογικά υλικά, τεχνικές οι οποίες υπερτερούν σε ευαισθησία και ειδικότητα. Η προσβολή των πνευμόνων από το παράσιτο L. infantum στη λεϊσμανίωση του σκύλου περιγράφηκε πρώτη φορά το 1937 και έκτοτε σε διάφορες μελέτες σε ιστοτεμάχια που λήφθηκαν κατά τη νεκροψία, φάνηκε ότι οι πνεύμονες προσβάλλονται και πολύ συχνά εμφανίζουν ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις συμβατές με χρόνια διάμεση πνευμονία. Οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις των πνευμόνων ωστόσο, σπάνια συνοδεύονταν από ανάλογα συμπτώματα, με αποτέλεσμα οι ειδικές διαγνωστικές εξετάσεις για τη διερεύνηση των αλλοιώσεων στους πνεύμονες να μην χρησιμοποιούνται συχνά. Κύριος σκοπός της διδακτορικής αυτής διατριβής ήταν η διερεύνηση της παρουσίας του παρασίτου L. infantum στους πνεύμονες και το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα σκύλων με λεϊσμανίωση, καθώς και η περιγραφή των ενδεχόμενων αλλοιώσεών τους χρησιμοποιώντας δειγματοληπτικές τεχνικές που μπορούν να εφαρμοστούν σε σκύλους ενζωή. Στη μελέτη μας συμμετείχαν 31 σκύλοι με λεϊσμανίωση από φυσική μόλυνση. Οι κηδεμόνες των σκύλων έδιναν ενυπόγραφη συγκατάθεση για τη συμμετοχή των σκύλων τους στη μελέτη μετά από σχετική ενημέρωση (Έγκριση κλινικής μελέτης: Συνεδρίαση της Γενικής Συνέλευσης του Τμήματος Κτηνιατρικής 56/ 24-06-2015). Σε όλους τους σκύλους, μετά την προσκόμισή τους στην Κλινική των Ζώων Συντροφιάς, του Τμήματος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. λαμβανόταν το ιστορικό και γινόταν κλινική εξέταση, αιματολογική, βιοχημική και ορολογική εξέταση, ανάλυση του ούρου, μέτρηση της αρτηριακής πίεσης και κυτταρολογική εξέταση των λεμφογαγγλίων και του μυελού των οστών. Οι σκύλοι που εμφάνιζαν κάποιο συνυπάρχον νόσημα ή αζωθαιμία, αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Σύμφωνα με τα ευρήματα της κλινικής εξέτασης και τα αποτελέσματα των εργαστηριακών εξετάσεων, το νόσημα σταδιοποιούνταν σε κάθε σκύλο ως ήπιου, μέτριου, σοβαρού και πολύ σοβαρού βαθμού. Στη συνέχεια, πραγματοποιούνταν ακτινολογική διερεύνηση του θώρακα υπό γενική αναισθησία. Ακολουθούσε βρογχοσκόπηση, κατά την οποία αξιολογούνταν και καταγράφονταν οι αλλοιώσεις του βλεννογόνου των βρόγχων, λήψη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, βιοψία του βλεννογόνου των βρόγχων και τυφλή, διαδερμική παρακέντηση του πνεύμονα. Σύμφωνα με τη σοβαρότητα και την έκταση των ευρημάτων της βρογχοσκόπησης, οι σκύλοι συγκέντρωναν ένα τελικό ενδοσκοπικό άθροισμα με εύρος που κυμαινόταν από 0-16.Από τη σταδιοποίηση του νοσήματος προέκυψε ότι 3/31 (10%) σκύλοι παρουσίαζαν ήπιου, 14/31 (45%) μέτριου, οι 13/31 (42%) σοβαρού και 1/31 (3%) πολύ σοβαρού βαθμού νόσημα. Βήχα αναπαραγώμενο κατά την ψηλάφηση της τραχείας εμφάνιζαν 5/31 (16,1%)σκύλοι, ενώ ακτινολογικές αλλοιώσεις στους πνεύμονες ανιχνεύτηκαν στους 12/31 (38,7%).Σε 19/31 (61,3%) σκύλους διαπιστώθηκαν αλλοιώσεις κατά τη βρογχοσκόπηση, που στην πλειονότητά τους στοιχειοθετούσαν μια ήπιου βαθμού εικόνα. Κατά την κυτταρολογική εξέταση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος παρατηρήθηκε κοκκιωματώδης και πυοκοκκιωματώδης φλεγμονή σε 14/31 (45,2%) σκύλους, ενώ το παράσιτο ανιχνεύτηκε σε έναν μόνο σκύλο. Σημαντικό παρασιτικό φορτίο ανιχνεύθηκε με την qPCR στα ιστοτεμάχια του βλεννογόνου των βρόγχων και στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, ενώ κατά την ιστοπαθολογική εξέταση διαπιστώθηκε χρόνια φλεγμονή στο βλεννογόνο των βρόγχων σε 24/31 (77,4%) σκύλους. Η ανοσοϊστοχημική εξέταση στα ιστοτεμάχια του βλεννογόνου των βρόγχων έδειξε αντιγονική δραστηριότητα σε 27/31 (87,1%) σκύλους, ενώ η ανοσοκυτταροχημική στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και το επίχρισμα από την παρακέντηση του πνεύμονα σε 30/31 (96,8%) και 27/31 (87,1%), αντίστοιχα. Οι παρουσία βήχα και αλλοιώσεων στην ακτινολογική εξέταση, τη βρογχοσκόπηση, την κυτταρολογική εξέταση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και την ιστοπαθολογική εξέταση δεν συσχετίστηκαν με το παρασιτικό φορτίο που προσδιορίστηκε με την qPCR. Οι βρογχοσκοπικές αλλοιώσεις ήταν ήπιας σοβαρότητας και στους σκύλους που εμφάνιζαν βήχα διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερο ενδοσκοπικό άθροισμα. Επομένως, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης μας προκύπτει ότι οι πνεύμονες μπορούν να προσβληθούν από το παράσιτο L. infantum, ωστόσο η εκδήλωση συμπτωμάτων από το αναπνευστικό σύστημα είναι σπάνια. Κατά τη βρογχοσκόπηση παρατηρούνται ήπιες κατά κανόνα αλλοιώσεις, ενώ στα ιστοτεμάχια του βλεννογόνου των βρόγχων, διαπιστώνεται χρόνια διάμεση πνευμονία. Το παρασιτικό φορτίο και το κλινικό στάδιο της λεϊσμανίωσης δεν σχετίζονται με τις αλλοιώσεις, ενώ η ανοσοϊστοχημεία και η ανοσοκυτταροχημεία εμφανίζουν τα υψηλότερα ποσοστά ανίχνευσης του παρασίτου στον πνεύμονα και το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα.