Πρωτεωμική προσέγγιση στην ανάλυση ρυθμιστικών σηματοδοτικών πορειών: ερυθροειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες

Abstract

GATA-1 is a key hematopoietic transcription factor that is required forerythrocyte differentiation. GATA-1 can positively or negatively regulateerythroid genes through its ability to form multiple protein complexes. In thisthesis we sought to discover new GATA-1 protein complexes by usingimproved in vivo biotinylation tagging coupled to mass spectrometry. In vivobiotinylation involves the covalent attachment of a biotin group to a smallpeptide tag (15-23 aa) fused to the protein of interest, by the bacterial biotinligase BirA and the very high affinity binding of the biotin-tagged protein bystreptavidin. We show that including Nonidet P-40 in the nuclear extractpreparation reduces background caused by the binding of endogenouslybiotinylated proteins. We also show that the use of alternative nuclear extractmethods, results in more efficient nuclear protein extraction of GATA-1 proteincompared to the commonly used high salt extraction method. By using thisimproved biotinylation tagging method we identify the novel interacting GATA-1 protein DNA methyltransferase I while being able to discard false positiveidentified interactions. We present an example of the latter by showing how GATA-1 interactions with TAF proteins as identified by mass spec, disappearupon nuclease digestion of nucleic acids from the nuclear extracts. Byapplying the biotinylation tagging approach for the reverse purification ofDNMT1 protein complexes, we confirmed the interaction with GATA-1 and wefurther identified novel interactions with key hematopoietic transcriptionfactors such as ZBP-89, ZNF143, Gfi-1b, FOG-1 and others. Validation ofthese interactions further suggested that DNMT1 forms a core complex withZBP-89 and ZNF143 and subcomplexes with GATA-1, FOG-1 and Gfi-1b. Inorder to map the DNMT-1 domains necessary for the interaction withtranscription factors, DNMT1 deletion mutants of the protein were used toshow that the domain responsible for interaction is the PCNA binding domain(PBD). This will be further used in order to unravel the biological significanceof the GATA-1 DNMT-1 interaction.

Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ταυτοποίηση και οχαρακτηρισμός νέων πρωτεϊνικών συμπλόκων του ερυθροποιητικού μεταγραφικού παράγοντα GATA-1, μέσω της εφαρμογής της μεθόδου in vivo βιοτινυλίωσης σε σύζευξη με φασματομετρία μάζας. Προκειμένου να γίνει ο χαρακτηρισμός των νέων πρωτεϊνικών συμπλόκων, βελτιώσαμε τη μέθοδο της in vivo βιοτινυλίωσης η οποία περιλαμβάνει την ομοιοπολική πρόσδεση βιοτίνης σε μια βραχεία αμινοξική αλληλουχία (15-23 αα) συζευγμένη με την υπό μελέτη πρωτεΐνη και την μετέπειτα κατακρήμνιση της βιοτινυλιωμένης πρωτεΐνης από σφαιρίδια στρεπταβιδίνης. Η βελτιωμένη μέθοδος οδήγησε στην ταυτοποίηση νέων αλληλεπιδρωσών πρωτεϊνών με τη GATA-1 όπως και ένα αριθμό πρωτεϊνών που κατακρημνίζονται μη ειδικά εξαιτίας της ύπαρξης νουκλεϊκών οξέων στα πυρηνικά εκχυλίσματα και οι οποίες είναι ικανές να οδηγήσουν στη ταυτοποίηση ψευδών θετικών αλληλεπιδράσεων. Ως ένα τέτοιο παράδειγμα ψευδούς θετικής αλληλεπίδρασης, παρουσιάζεται η αλληλεπίδραση της GATA-1 με τις πρωτεΐνες TAF, ενώ παρουσιάζονται και αποτελέσματα που δείχνουν ότι η χρήση ειδικών νουκλεασών για την διάσπαση των νουκλεϊκών οξέων σε πυρηνικά εκχυλίσματα μειώνει αισθητά τις μη ειδικές πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Επίσης, από τα αποτελέσματα της φασματομετρίας μάζας αναγνωρίσθηκε η DNA μεθυλοτρανσφεράση Ι ως αλληλεπιδρώσα με τη GATA-1 πρωτεΐνη μαζί με τους μεταγραφικούς παράγοντες ZBP-89 και ZNF143. Η ύπαρξη του συγκεκριμένου συμπλόκου επιβεβαιώθηκε από σειρά πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης. Με τη χρήση απαλειπτικών μεταλλάξεων της DNMT-1 βρέθηκε η περιοχή PBD ως υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση με το σύμπλοκο GATA-1/ZBP-89/ZNF143.Ο χαρακτηρισμός της περιοχής που είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση επιτρέπει τη διατάραξη του πρωτεϊνικού συμπλόκου με σκοπό τη διασαφήνιση της λειτουργικής σημασίας του πρωτεϊνικού συμπλόκου και του σκοπού που επιτελεί στην ερυθροποίηση.