Μοριακή μελέτη παθήσεων θυρεοειδούς αδένα

Abstract

The pathologies of the thyroid gland constitute a common health issue, demanding accurate diagnosis and treatment. As new evidence emerges, new diagnostic methods, prognostic tools and treatment protocols are implemented. The elucidation of molecular mechanisms of diseases is important for the identification of useful prognostic markers in patients, especially in those being at high risk. To date, there is no way to diagnose non-invasively thyroid cancer and to monitor the progression of this disease. MicroRNAs (miRNAs) are small, endogenous, single-stranded, non-coding RNA molecules of approximately 22 nucleotides. They act post-transcriptionally and regulate negatively their targets, depending on the complementarity with their mRNA targets. The aim of the present PhD thesis was to contribute to the development of new tools for the accurate and non-invasive diagnosis of thyroid cancer. For this purpose, we collected 35 cancerous tissue samples and adjacent normal thyroid tissue samples from patients with papillyary throid cancer. In 16 out of 35 patients, we also collected preoperative blood serum. Moreover, we collected blood sera from 48 additional patients with papillary thyroid cancer as well as from 72 patients with non-cancerous thyroid (e.g. bening thyroid tumors, hyperparathyroidism etc.). We performed thyroid tissue homogenization and isolated total RNA from these homogenized tissue samples as well as from the aforementioned blood sera. Next, we determined the concentration and purity of the extracted total RNA. After that, we performed miRNA-seq. Moreover, we carried out total RNA polyadenylation and reverse transcription into first-strand cDNA, followed by quantitative real-time PCR (qPCR). Last, we extensive biostatistical analysis was performed on qPCR results. Among the identified miRNAs, the ten most promising miRNAs in terms of variation of their expression are the following: miR-125a-5p, miR-144-3p, miR- 622, miR-361-5p, miR-146a-3p, miR-340-5p, miR-199a-5p, miR-205-5p, miR- 335, and miR-129-5p. The levels of these miRNAs were significantly different between cancerous and non-cancerous thyroid tissues. Using the developed qPCR protocols, we validated the expression results regarding these ten miRNAsin the four pairs of cancerous and adjacent normal thyroid tissues, and the we extended quantification of these ten miRNAs in another 31 pairs of thyroid tissues. Eight out of these ten miRNAs (all but miR-125a-5p and miR-205-5p) were differentially expressed at a statistically significant level between cancerous and paired non-cancerous thyroid tissues. We also found that high expression of miR-144-3p, miR-146a-3p and miR-340-5p, as well as low expression of miR-622, miR-361-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, and miR-129-5p is associated with particular clinicopathological features, such as lymph node infiltration, extrathyroidal infiltration, and the existence of multifocal tumors. The levels of five out of eight miRNAs were significantly different in the serum of patients with papillary thyroid cancer, compared to the serum samples of patients with other (non-malignant) thyroid pathologies. Τα miRNAs αυτά ήταν τα εξής: miR-144-3p, miR-146a-3p, miR-340-5p, miR-199a-5p και miR-335. Moreover, biostatistical analysis including construction of ROC curves and univariate logistic regression showed that the expression of these five miRNAs can discriminate between patients with papillary thyroid cancer and other patients or normal population. Thus, these five miRNAs could be combined for the differential diagnosis of papillary thyroid cancer. The levels of the five selected miRNAs (miR-144-3p, miR-146a-3p, miR-340-5p, miR-199a-5p, and miR-335) in blood serum of patients are associated with particular clinicopathological features, at a statically significant level. In conclusion, according to the results of the present PhD thesis, a molecular signature consisting of miR-144-3p, miR-146a-3p, miR-340-5p, miR- 199a-5p and miR-335 is likely to able to diagnose papillary thyroid cancer with high sensitivity and specificity, starting from a blood sample. People with deregulated levels of at least 4 of these 5 miRNAs are very likely to be diagnosed with papillary thyroid cancer, compared to the rest of the population. The differential diagnostic potential of this molecular signature is rathe independent of other factors. Last, the deregulation of the expression levels of these 5 miRNAs is associated with clinicopatholofical features of malignant papillary thyroid tumors.

Η παθολογία του θυρεοειδούς αποτελεί ένα συχνά απαντώμενο και δαπανηρό πρόβλημα υγείας που απαιτεί σαφή διαγνωστική προσέγγιση και ορθή αντιμετώπιση. Καθώς νέα δεδομένα προκύπτουν διαρκώς, δημιουργείται η δυνατότητα για βελτιωμένα πρωτόκολλα διάγνωσης, κατηγοριοποίησης και διαχείρισης των ασθενών. Η αποσαφήνιση μοριακών και βιολογικών μηχανισμών των νόσων είναι σημαντική στο καθορισμό χρήσιμων προγνωστικών δεικτών στους ασθενείς και ιδιαίτερα σε εκείνους υψηλού κινδύνου. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει τρόπος μη παρεμβατικής διάγνωσης και παρακολούθησης του καρκίνου του θυρεοειδούς αδένα. Τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενή μονόκλωνα μόρια RNA που η αλυσίδα τους αποτελείται από περίπου 22 νουκλεοτίδια, τα οποία δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Δρουν στο προ-μεταγραφικό επίπεδο και ρυθμίζουν αρνητικά τους στόχους τους ανάλογα με το βαθμό συμπληρωματικότητας ανάμεσα στο miRNA και το γονίδιο στόχο. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι να συμβάλλει στη δημιουργία νέων εργαλείων για ακριβή και μη επεμβατική διάγνωση του καρκίνου του θυρεοειδούς αδένα. Για την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής, συλλέχθηκαν μονιμοποιημένα σε παραφίνη ιστολογικά δείγματα θυρεοειδούς, ήτοι 35 δείγματα από θηλώδες καρκίνωμα και ισάριθμα δείγματα από παρακείμενο φυσιολογικό θυρεοειδή αδένα. Σε 16 από τους 35 αυτούς ασθενείς, κατέστη δυνατή η συλλογή προεγχειρητικού ορού αίματος. Επίσης, συλλέχθηκαν προεγχειρητικοί οροί αίματος επιπλέον από 48 ασθενείς με θηλώδες καρκίνωμα θυρεοειδούς, καθώς και από 72 ασθενείς με άλλες παθήσεις του θυρεοειδούς αδένα (π.χ. από άτομα με καλοήθεια στο θυρεοειδή, με υπερπαραθυρεοειδισμό κλπ.). Έγινε ομογενοποίηση ιστολογικών δειγμάτων θυρεοειδούς αδένα και απομόνωση ολικού RNA από τα ομογενοποιημένα δείγματα και από ορό αίματος. Ακολούθησε προσδιορισμός της συγκέντρωσης και έλεγχος της καθαρότητας και ακεραιότητας του απομονωμένου ολικού RNA. Στη συνέχεια, έγινε αλληλούχηση RNA κατόπιν εμπλουτισμού για τα miRNAs. Έλαβε χώρα πολυαδενυλίωση ολικού RNA και αντίστροφη μεταγραφή του σε μονόκλωνοcDNA, και ποσοτική real-time PCR. Τέλος, έγινε βιοστατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της ποσοτικής real-time PCR.Βρέθηκε ότι δέκα πιο συχνά μεταβαλλόμενα ως προς την έκφρασή τους miRNAs είναι τα εξής: miR-125a-5p, miR-144-3p, miR-622, miR-361-5p, miR- 146a-3p, miR-340-5p, miR-199a-5p, miR-205-5p, miR-335 και miR-129-5p. Τα επίπεδα των παραπάνω miRNAs διέφεραν στατιστικώς σημαντικά ανάμεσα σε καρκινικούς και φυσιολογικούς ιστούς θυρεοειδούς. Στη συνέχεια, με τις αναπτυχθείσες μεθοδολογίες real-time PCR, ποσοτικοποιήθηκε η έκφραση των δέκα αυτών miRNAs, πρώτα στους οκτώ επιλεγμένους ιστούς (ήτοι στα 4 ζεύγη) και στη συνέχεια σε ακόμα 31 ζεύγη. Από τα δέκα αυτά miRNAs, οκτώ (ήτοι όλα πλην των miR-125a-5p και miR-205-5p) παρουσίασαν στατιστική σημαντικότητα ως προς τις διαφορές μεταξύ καρκινικών και αντίστοιχων φυσιολογικών δειγμάτων. Επίσης, βρέθηκε ότι η υψηλή έκφραση των miR-144- 3p, miR-146a-3p και miR-340-5p, καθώς και η χαμηλή έκφραση των miR-622, miR-361-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p και miR-129-5p, συσχετίζεται με συγκεκριμένα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά, όπως με ύπαρξη λεμφαδενικών μεταστάσεων, εξωκαψική διήθηση και πολυεστιακότητα των καρκινικών όγκων του θυρεοειδούς αδένα. Τα επίπεδα πέντε εκ των παραπάνω οκτώ miRNAs διέφεραν στατιστικώς σημαντικά ανάμεσα σε ορούς αίματος από ασθενείς με θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς αδένα και σε λοιπούς ασθενείς. Τα miRNAs αυτά ήταν τα εξής: miR-144-3p, miR-146a-3p, miR-340-5p, miR-199a-5p και miR-335. Επίσης, με βιοστατιστική ανάλυση η οποία περιελάβανε την κατασκευή καμπυλών ROC, καθώς και μονομεταβλητή λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης, φάνηκε ότι μπορούν να διακρίνουν τους μεν από τους δε ασθενείς. Η δε πολυμεταβλητή λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι τα πέντε αυτά miRNAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν συνδυαστικά για τη (διαφορο)διάγνωση θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς αδένα. Tα επίπεδα των πέντε επιλεγμένων miRNA (ήτοι: miR-144-3p, miR-146a-3p, miR- 340-5p, miR-199a-5p και miR-335) στο αίμα συσχετίζονται στατιστικώς σημαντικά με συγκεκριμένα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των καρκινοπαθών. Συμπερασματικά, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μια «μοριακή υπογραφή» αποτελούμενη από τα miR-144-3p, miR-146a-3p, miR-340-5p, miR-199a-5p και miR-335 είναι ικανή να διαγνώσει με μεγάλη ακρίβεια και ευαισθησία το θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς, από δείγμα αίματος. Άτομα με διαταραγμένα επίπεδα τεσσάρων (ή πέντε) από τα παραπάνω πέντε miRNAs έχουν πολλαπλάσια πιθανότητα να διαγνωσθούν με θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς αδένα, σε σχέση με τον υπόλοιπο πληθυσμό. Η διαφοροδιαγνωστική ικανότητα αυτής της «μοριακής υπογραφής» είναι ανεξάρτητη. Τέλος, η διαταραχή των επιπέδων των πέντε αυτών miRNAs σχετίζεται με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά του θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς αδένα.