Μελέτη ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου και παραγόντων που εμπλέκονται στη διεργασία αποδόμησης των P21cip1 και P27kip1 σε λεμφώματα β-κυτταρικής αρχής: συσχέτιση με κλινικές παραμέτρους

Abstract

Cell cycle is tightly regulated by a functionally conserved group of proteins which together constitute the basic cell division machinery that controls cell cycle progression. Altered expression of these proteins are almost always detected in human cancer cells. However, aberrant expression of these proteins can be the cause of malignant transformation but also in some cases, can be the consequence of cancer progression. The cell cycle regulators p27 and p21 play a central role in the suppression of tumorigenesis in a variety of human cancers. Of particular importance for the development of human cancers is the ubiquitin dependent degradation of p27 and p21 by the proteasome. This pathway is controlled by many complexes, however the most well studied is the SCFSkp2 complex. p27 and p21 proteins are phosphorylated at a conserved Threonine (T187) and Serine (Ser130) residue by cyclin E/A-cdk2 complexes, respectively, and the Skp2 protein facilitates the polyubiquitylation of p27 and p21 by the SCF complex. In the present study was examined the immunoexpression of p27, p21, Skp2, cul1, pThr187-p27, cyclin Α, cyclin Ε and CDK2 in 135 cases with B-cell Lymphoma with aggressive [66 DLBCL (35 nodal and 31 extranodal), 13 MCL (8 classical and 5 blastic) and 5 FL grade 3α/β)] and indolent biological behaviour [9 FL (3 G1, 6 G2), 20 MZL (12 nodal, 6 extranodal, 2 splenic) and 22 SLL]. P27 was overexpressed in indolent B-cell lymphomas. However, many cases with aggressive B-cell lymphoma, mainly DLBCLs (~40%, >30%), showed increased expression of p27. In addition, all lymphoma cases except the FLs and MZLs failed to show an inverse correlation between p27 and Skp2. The highest expression of p21 was observed in DLBCL, indicating that p21 expression is associated with more aggressive neoplasias. The levels of p21 expression did not correlate with Skp2 and cul1, indicating that SCFSkp2 complex might not be capable for p21 degradation in B-cell lymphomas. Overexpression of Skp2 in DLBCLs, MCLs (mainly blastic type) and FL (Grade 3), as well as the strong positive correlation with cyclin A and CDK2, indicate that Skp2 may be a putative biomarker of tumor aggressiveness. The expression of cul1 was higher in DLBCLs, and correlate well with the expression of Skp2, indicating the presence of active SCFSkp2 complex. However, a similar correlation was not observed in other lymphoma groups. The phosphorylated form of p27 (pThr187-p27) was overexpressed in aggressive cases. Furthermore, a strong positive correlation between pThr187-p27 and the proliferation index, was observed in all lymphoma cases. This correlation may indicate that pThr187-p27 could be used as a marker of tumor aggressiveness. The correlation of the studied proteins with the clinical and laboratory data showed that in the aggressive lymphomas the expression of Skp2 and pThr187-p27 is associated with poor disease free survival rate, and pThr187-p27 is also associated with shorter overall survival. In the present study, the multivariant cox analysis showed that the expression of pThr187-p27 is an independent prosgnostic factor for the overall survival among other clinical parameters.

Κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου ένας από τους σημαντικότερους μηχανισμούς ρύθμισης της ομοιόστασης των πρωτεϊνικών μορίων είναι η ελεγχόμενη στο χώρο και στο χρόνο αποδόμηση τους. Οποιαδήποτε ανωμαλία στη ρύθμιση των μηχανισμών αποδόμησης των πρωτεϊνών μπορεί να προκαλέσει σημαντική βλάβη στη λειτουργία του κυττάρου και να οδηγήσει σε κακοήθη εξαλλαγή του. Η αποδόμηση των κύκλινο-εξατώμενων αναστολέων του κυτταρικού κύκλου, p27 και p21, έχει δειχθεί να αυξάνει κατά την καρκινογένεση. Αν και η πρωτεόλυση των p27 και p21 έχει δειχθεί να μεσολαβείται από διαφορετικά μονοπάτια ωστόσο το περισσότερο γνωστό και καλύτερα τεκμηριωμένο είναι το μονοπάτι μέσω του συμπλόκου SCF (Skp2-cul1-Skp1) Ε3 λιγάσης της ουβικουιτίνης. Αρχικά οι πρωτεΐνες p27 και p21 φωσφορυλιώνονται από το σύμπλκο κυκλίνης Ε/Α-CDK2 στη θρεονίνη 187 (Thr187) και στη σερίνη 130 (Ser130) αντίστοιχα, και εν συνεχεία αναγνωρίζονται από το σύμπλοκο SCFSkp2, το οποίο διευκολύνει την πολύ-ουβικουιτινυλίωση και την αποδόμηση των πρωτεϊνών στο πρωτεόσωμα. Στη παρούσα εργασία μελετήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών: p27, p21, Skp2, cul1, pThr187-p27, κυκλίνη Α, κυκλίνη Ε και CDK2 σε 135 περιπτώσεις Β-λεμφωμάτων με Επιθετική [66 ΔΛΜΒΚ (35 λεμφαδενικά και 31 εξωλεμφαδενικά), 13 ΛΚΜ (8 κλασσικά και 5 βλαστικά) και 5 με ΛΛ βαθμού 3α/β)] και Ήπια βιολογική συμπεριφορά [9 ΛΛ (3 βαθμού 1, 6 βαθμού 2), 20 ΛΟΖ (12 λεμφαδενικά 6 εξωλεμφαδενικά, 2 σπληνικά) και 22 ΛΜΚ]. Η έκφραση της p27 παρατηρήθηκε μέγιστη στα ήπια λεμφώματα. Ωστόσο σε αρκετές περιπτώσεις επιθετικού λεμφώματος, κυρίως ΔΛΜΒΚ (~40%, >30%), η έκφραση της p27 βρέθηκε αυξημένη. Επιπλέον, σε όλες τις περιπτώσεις λεμφωμάτων εκτός του λεμφοζιδιακού και της οριακής ζώνης, παρουσιάστηκε αδυναμία αρνητικής συσχέτισης μεταξύ της p27 και της Skp2. Η μέγιστη έκφραση της p21, αντίθετα με την p27, παρατηρήθηκε στα ΔΛΜΒΚ, γεγονός που συνδέει την p21 με επιθετικότερη νόσο. Η πρωτεΐνη p21 δεν έδειξε να συσχετίζεται με τις πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την αποδόμηση της, γεγονός που πιθανόν να υποδεικνύει ότι στα Β-λεμφώματα που μελετήθηκαν η p21 δεν πρωτεολύεται από το σύμπλοκο SCFSkp2. Η υπερέκφραση της Skp2 στα ΔΛΜΒΚ, ΛΚΜ (κυρίως βλαστικά) και ΛΛ (βαθμού 3) καθώς και η ισχυρή θετική συσχέτιση με το δείκτη πολλαπλασιασμού, την κυκλίνη Α και τη CDK2 προσδίδουν στη πρωτεΐνη χαρακτηριστικά δείκτη επιθετικότητας. H cul1 έδειξε τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης και μία ισχυρή θετική συσχέτιση με την Skp2 στα ΔΛΜΒΚ, υποδεικνύοντας την παρουσία ενεργού SCF συμπλόκου, ωστόσο δεν παρατηρήθηκε παρόμοια συσχέτιση στους άλλους τύπους λεμφώματος. Υπερέκφραση της φωσφορυλιωμένης μορφής της p27 (pThr187-p27), δείχθηκε στα επιθετικότερα λεμφώματα. Επιπλέον, ισχυρή θετική συσχέτιση με το δείκτη πολλαπλασιασμού έδειξε η pThr187-p27, σε όλους τους τύπους λεμφώματος, δείχνοντας μία πιθανή σύνδεση της pThr187-p27 με την επιθετικότητα της νόσου. Συσχέτιση των παραπάνω πρωτεϊνών με τα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα των των ασθενών δείχνουν ότι στα επιθετικά λεμφώματα η υπερέκφραση των Skp2 και pThr187-p27 συνδέεται με βραχύτερο διάστημα ελεύθερο νόσο, ενώ η υπερέκφραση της pThr187-p27 έδειξε να συνδέεται και με πτωχότερη ολική επιβίωση. Επίσης κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση, δείχθηκε για πρώτη φορά ότι η έκφραση της pThr187-p27 αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για τη συνολική επιβίωση όχι μόνο ανάμεσα στις υπό μελέτη πρωτεΐνες αλλά και σε συνάρτηση με τις κλινικές παραμέτρους στα επιθετικά Β-λεμφώματα.