Μεταγραφική ρύθμιση μέσω διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων και τρισδιάστατης δομής του πυρήνα

Abstract

Fine tuning of transcriptional regulation is achieved by interchromosomal interactions and the incorporation of histone variants in exchange of canonical histones. The histone variant macroH2A1 is found in two spliced isoforms, macroH2A1.1, which contains an ADP-ribose binding pocket and macroH2A1.2. We have used ChIP-seq, luciferace assays and protein interaction studies to identify how binding of NAD+ metabolites regulates macroH2A1 function. We found that macroH2A1 associates with long stretches of DNA and ~50% of binding sites are bound by both isoforms. Interaction with Parp1 regulates transcriptional repression and the vast majority of their binding sites are at known transcriptional promoters. Interchromosomal interactions of a single IFNβ allele with 3 defined genetic elements termed NRCs (NF-κB Reception Centers), in a small percentage of infected cells, triggers enhanceosome assembly and monoallelic expression. To study the molecular mechanisms driving the interactions, we generated stable cell lines bearing WT or mutant NRCs followed by DNA FISH analysis to determine their ability to interact with the IFNβ gene. We identified a GAGA element that is bound by the Zinc Finger DNA binding protein ThPOK in a cooperative fashion with NF-κB and all of which are required for the establishment of transcriptionally productive interchromosomal interactions. Knock down of ΤhPOK caused a significant reduction of the virus-induced NRC- IFNβ interchromosomal interactions and IFNβ expression levels. These experiments suggest that ThPOK is a crucial regulator of the virus induced stochastic interchromosomal associations controlling the expression of the IFNβ gene.

Η λεπτή ρύθμιση της μεταγραφής επιτυγχάνεται με διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις και την ενσωμάτωση των ιστονικών ποικιλομορφών αντί των κανονικών ιστονών. Η ιστονική ποικιλομορφή macroH2A1 βρίσκεται σε δύο προϊόντα εναλλακτικού ματίσματος, την macroH2A1.1, η οποία περιέχει μια θέση πρόσδεσης ADP-ριβόζης και την macroH2A1.2. Έχουμε χρησιμοποιήσει ChIP-seq, αναλύσεις luciferace και μελέτες αλληλεπίδρασης πρωτεΐνων για να προσδιορίσουμε πως η πρόσδεση των NAD + μεταβολιτών ρυθμίζει τη λειτουργία της macroH2A1. Βρήκαμε ότι οι macroH2A1 συσχετίζεται με μεγάλα τμήματα του DNA και ~ 50% των θέσεων πρόσδεσης δεσμεύεται και από τις δύο ισομορφές. Η αλληλεπίδραση με την Parp1 ρυθμίζει τη μεταγραφική καταστολή και η συντριπτική πλειοψηφία των θέσεων δέσμευσής τους είναι σε γνωστούς υποκινητές γονιδίων. Οι διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις ενός μοναδικού αλληλόμορφου ΙFΝ-β με 3 γενετικούς τόπους που ονομάζονται NRCs (NF-κΒ Κέντρα Υποδοχής), σε ένα μικρό ποσοστό μολυσμένων κυττάρων, οδηγεί σε συναρμολόγηση του ενισχυοσώματος και μονοαλληλική έκφραση. Για τη μελέτη των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν τις αλληλεπιδράσεις, δημιουργήσαμε σταθερές κυτταρικές σειρές που φέρουν WT ή μεταλλαγμένα ΝRCs και με ανάλυση FISH DNA καθορίσαμε την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με το γονίδιο της ΙFΝ-β. Έχουμε εντοπίσει ένα στοιχείο GAGA που δεσμεύεται από την πρωτεΐνη ThPOK σε συνεργατική πρόσδεση με τον NF-κΒ και τα οποία απαιτούνται για τη δημιουργία μεταγραφικά παραγωγικών αλληλεπιδράσεων. Αποσιώπηση του ΤhPOK προκάλεσε σημαντική μείωση των NRC- ΙfΝ-β διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων και τα επίπεδα έκφρασης της ΙFΝ-β. Αυτά τα πειράματα υποδηλώνουν ότι o ThPOK είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής των επαγόμενων από ιό διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων που ελέγχουν την έκφραση του γονιδίου της ΙFΝ-β.