Μελέτη της δυναμικής μεταγραφικών συμπλόκων in vivo

Abstract

The first line of antiviral response is laying in the production and secretion of the interferon type I proteins, which, subsequently bind to their specific receptors at the surface of healthy and infected cells in order to activate a large number of antiviral genes. The products of those genes (transcription factors, cytokines etc) act by inhibiting the penetration or/and replication of the virus inside the cells. The infection of human cells with different types of viruses induces the transcription of the interferon beta (IFN-β) gene, through the coordinate activation of three distinct groups of transcription factors (NF-kB, ATF-2/c-JUN, IRFs). The latter bind to the enhancer of the IFN-β gene in a cooperative manner and they create, in combination with the architectural protein HMGI(Y), a nucleoprotein complex, known as enhanceosome. The enhancesome, after its formation the nucleosome-free enhancer, instructs the ordered recruitment of several so-activators and basal transcription factors at the adjacent promoter. The recruitment program culminates with the sliding of the nucleosome masking the promoter, allowing the RNA polymerase II binding and the subsequent transcriptional initiation. Both the cooperativity in the binding of transcription factors to the enhancer of the gene and the synergy in the recruitment of the co-activators at the enhanceosome, imply an extremely complex and accurate mechanism of combinatorial control of the transcriptional activation of the IFN-β gene. Another striking feature of the IFN-β gene expression, as well as many other cytokine genes, is that even under optimal conditions, only a fraction of the cells in the population (~22% for the IFN-β) expresses the cytokine gene at any given moment. This heterogeneity is known as stochasticity and it is observed, usually, in biological systems or procedures, characterized by high complexity and low concentrations of the implicated molecules. One attractive model proposes that the stochasticity is correlated with the transcription process itself and therefore is likely associated with the inherent complexity of enhanceosome assembly on the IFN-β enhancer/promoter. Since the enhanceosome assembly is a cooperative process, we wondered whether limiting concentrations of one or some of the IFN-β activators account for the stochastic assembly of enhanceosomes, thus leading to binary transcriptional switches. Our results showed that at least two of the transcription factors bound to the IFN-β enhancer, specifically NF-κΒ and IRF-7, play a true limiting role in the possibility of the IFN-β gene expression. This conclusion derived from the fact that exogenous increase of their concentration induces a significant increase at the percentage of cells that finally respond to the virus infection. The low concentration of those factors arise a reasonable question regarding the mechanism by which these factors locate their special binding sites nearby their target genes within the genomic “chaos” in the 3D nucleus. We focused, mainly, to the mechanism of the limiting NF-κΒ targeting to its target genes, and specifically to the IFN-β, because, firstly NF-κΒ is the first transcription factor nucleating the enhanceosome assembly and secondly, there have been found (by genome-wide methods or bioinformatics analysis) millions putative NF-κΒ binding sites within the human genome. We form a working hypothesis that some of these binding sites are specific in receiving immediately NF-κΒ and transferring it at the target genes through interchromosomal interactions. By applying several technically advanced molecular techniques, such as 4C-ChIP and DNA FISH, we identified three genomic regions located in different chromosomes, interacting specifically with the IFN-β gene through NF-κΒ. All these regions are localised away from transcribed regions contain a specialized NF-kB binding site as a part of an Alu repetitive element and they have previously, unknown function. Our experiments showed that these interchromosomal interactions (involving only one allele of each interacting locus) are virus inducible and occur at high frequencies during enhanceosome formation, whereas they are significantly reduced at the transcriptional initiation or extension. In order to study the functional role of these interactions on the transcriptional activation of the IFN-β gene, we performed the RNA/DNA FISH technique. Surprisingly, this method revealed that the IFN-β gene is expressed monoallelically. Importantly, the single transcriptionally active IFN-β allele is the one interacting with -at least- one of the 3 genomic regions, described above. These results lead to the reasonable hypothesis that an increase the frequency of the inter-chromosomal associations would increase the probability of the IFN-β expression. Indeed, transient transfection of HeLa cells with multiple copies of each of the 3 genomic regions resulted to significant increase to both the percentage of the IFN-β expressing cells and the total IFN-β mRNA levels. Additionally, we found that the positive effect of the multiple copies on the IFN-β expression levels is dependent on the specialized NF-κΒ binding site present in these regions. This phenomenon is explained by the fact that NF-κΒ associates first with the 3 genomic regions and then is transferred to the IFN-β locus, as revealed by ChIP experiments with chromatin isolated by cells infected with virus in time course manner. Furthermore, the observation that the 3 genomic regions exist in physical proximity even before the entrance of NF-κΒ in the nucleus suggests that probably they form an “NF-kB receptor center”, which can receive immediately the NF-κB and distribute the factor to the promoters of selected genes via interchromosomal interactions. We do not know the mechanism assuring the immediate binding of NF-κB to the genomic regions of interest and the specificity of these interchromosomal interactions since not all the NF-κB regulated genes (e.g. IL-8) are recruited to the NF-κB center. We can imagine that the NF-κB receptor center is localized in specialized subnuclear regions to which the incoming NF-κB can have instant access. Support for such a model comes from the fact that the affinity of NF-κB for these specialized sites is 2-3 times lower than that of the IFN-β gene, implying that its preference for the receptor center could be due either the local nuclear architecture, the DNA-induced allostery and/or other proteins localized in this microenvironment. In parallel, we studied the mechanism driving the long-range movements of the described genomic regions. Our preliminary results showed that the observed translocations are ATP-dependent and, furthermore they require the presence of some co-activators, like the CBP/p300 and the chromatin remodelling complex SWI/SNF. Certainly, the clarification of the underlying mechanism demands additional extensive research using molecular, biochemical and cytological methods. All the previous results prove that the stochastic monoallelic expression of the IFN-β gene as response to virus infection is dependent on interchromosomal interactions with 3 genomic regions. These interactions mediate the binding of the limiting factor NF-κB to the enhancer of a single IFN-β allele, which is selected probabilistically. The bound NF-κΒ orchestrates the enhanceosome assembly in this allele leading to the transcriptional activation. Furthermore, we studied the IFN-β expression at the later time-points of viral infection (8-10 hours after virus). We observed that the IFN-β production is significantly enhanced, because both the percentage of IFN-β expressing cells and the number of expressing alleles per cell are increased. The gradual conversion of mono-allelic expression to multi-allelic is independent from interchromosomal associations. In order to elucidate the underlying mechanism, we first tested the possible role of the secreted IFN-β protein in a mean of positive feedback loop. Our experiments, validated this assumption, since they proved that the initially and mono-allelically produced IFN-β triggers the transcriptional activation of more alleles in additional cells, through the IFN-β signal transduction pathway and specifically, through the activation of the IRF-7 factor. Since, the IRF-7 is one of the limiting transcription factors of the IFN-β gene, the increased intracellular concentration probably ensures its binding to the promoter of initially non- expressing alleles, where it organizes the enhanceosome assembly, triggering a second wave of IFN-β production by additional cells and additional alleles per cell. Summarizing, in our current study we present strong evidence for a model of biphasic IFN-β gene expression. According to this model, at the early phase virus infection the IFN-β gene is expressed stochastically from a single allele in a small proportion of cells. The choice of the allele to be expressed is dependent on interchromosomal associations between the IFN-β gene and at least one of the three distinct genomic loci that could mediate binding of the NF-κΒ to the IFN-β enhancer. Then, the limiting NF-κΒ nucleates enhanceosome assembly, a prerequisite for chromatin remodeling and activation of transcription from this allele. The secreted IFN-β protein induces increased intracellular levels of the IRF-7 factor, which in turn orchestrates the enhanceosome formation in the remaining alleles in additional cells. Thus, the IFN-β enhancer functions in a non-linear fashion by working as a signal amplifier. Finally, in the current study we showed that it is possible to manipulate experimentally the probability of the IFN-β gene expression by two distinct ways. The first is lying on the direct increase of the concentration of the limiting transcription factors. As a result, the artificially high concentration factor has high probability to find and bind randomly to the enhancer of any allele in every cell. Then, the bound factor will recruit cooperatively the rest components of the enhanceosome, leading to the transcriptional activation of multiple alleles in many more cells. The second mechanism exploits the role of the interchromosomal interactions. It is the first time that someone reveals that the expression probability of a gene could be raised by increasing the copy number of an intergenic (noncoding) region, which is capable to receive immediately a low abundance factor and deliver it to the target gene. Remarkably, the construction of stable cell lines with multiple copies of such a genomic region resulted to: 1) increased expression levels of the IFN-β gene, 2) earlier and more immediate response to the virus infection and finally, 3) higher sensibility of the cells, which become able to “sense” and respond to lower viral titles.

Η πρώτη γραμμή αντι-ικής άμυνάς μας βασίζεται στην παραγωγή κι έκκριση ειδικών πρωτεϊνών που ονομάζονται ιντερφερόνες τύπου Ι, οι οποίες στη συνέχεια, προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια τόσο υγειών όσο και μολυσμένων κυττάρων ενεργοποιώντας έναν μεγάλο αριθμό γονιδίων με αντιική δράση. Τα προϊόντα των γονιδίων αυτών (μεταγραφικοί παράγοντες, κυτοκίνες, ένζυμα υδρόλυσης νουκλεικών οξέων κ.α) δρουν προλαμβάνοντας την εισβολή ή/και τον πολλαπλασιασμό των ιών μέσα στα κύτταρα. Η μόλυνση των ανθρώπινων κυττάρων με διάφορους τύπους ιών προκαλεί την άμεση μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της ιντερφερόνης β (IFN-β). Αυτό επιτυγχάνεται με τη συντονισμένη ενεργοποίηση τριών ομάδων μεταγραφικών παραγόντων (NF-kB, ATF-2/cJUN, IRFs), οι οποίοι μαζί με την αρχιτεκτονική πρωτείνη HMGI(Y) προσδένονται στον ενισχυτή του γονιδίου της IFN-β και δημιουργούν ένα αρχιτεκτονικά πολύπλοκο νουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, γνωστό ως ενισχυόσωμα (enhanceosome). Το ενισχυόσωμα, αφού συγκροτηθεί στον ελεύθερο από νουκλεοσώματα ενισχυτή, καθοδηγεί τη στρατολόγηση μιας σειράς πρωτεϊνών που τροποποιούν τη χρωματίνη, συνενεργοποιητών και βασικών μεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή. Το πρόγραμμα στρατολόγησης ολοκληρώνεται με την ολίσθηση του νουκλεοσώματος που κάλυπτε τον υποκινητή, επιτρέποντας έτσι, την πρόσδεση της RNA πολυμεράσης ΙΙ και την έναρξη της μεταγραφής. Η συνεργατικότητα (cooperativity) με την οποία προσδένονται οι μεταγραφικοί παράγοντες στον ενισχυτή του γονιδίου, και η συνέργεια (synergy) που χαρακτηρίζει τον τρόπο στρατολόγησης των παραγόντων στο ενισχυόσωμα, υποδηλώνουν έναν εξαιρετικά πολύπλοκο κι ακριβή μηχανισμό συνδυαστικού ελέγχου της μεταγραφικής ενεργοποίησης του γονιδίου της IFN-β. Ένα επιπρόσθετο ιδιαίτερο γνώρισμα της έκφρασης της IFN-β (Zawatzky et al., 1985), όπως και πολλών άλλων κυτοκινών, είναι ότι ακόμη και υπό ιδανικές συνθήκες μόνο ένα περιορισμένο ποσοστό κυττάρων (~22% για την IFN-β) σε έναν πληθυσμό εκφράζει το γονίδιο της κυτοκίνης κάθε δεδομένη στιγμή. Αυτή η ετερογένεια χαρακτηρίζεται ως στοχαστικότητα ή πιθανοκρατία και εμφανίζεται, συνήθως, σε βιολογικά συστήματα ή διεργασίες, που χαρακτηρίζονται από πολυπλοκότητα και χαμηλές συγκεντρώσεις των εμπλεκόμενων μορίων. Ένα ελκυστικό μοντέλο υποστηρίζει ότι η ίδια η μεταγραφική διαδικασία είναι υπεύθυνη για τη στοχαστική έκφραση κι αυτό, πιθανόν, να συνδέεται με την εγγενή πολυπλοκότητα της συγκρότησης του ενισχυοσώματος στον ενισχυτή/υποκινητή του γονιδίου της IFN-β. Δεδομένου ότι η οργάνωση του ενισχυοσώματος είναι μια συνεργατική διαδικασία, αναρωτηθήκαμε αν η πιθανώς περιορισμένη συγκέντρωση ενός ή περισσοτέρων ενεργοποιητών της IFN-β συμβάλλει στην στοχαστική συγκρότηση ενισχυοσωμάτων οδηγώντας έτσι σε διπλούς μεταγραφικούς διακόπτες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι δύο τουλάχιστον από τους μεταγραφικούς παράγοντες που συνδέονται στον ενισχυτή της IFN-β, ο NF-κΒ κι ο IRF-7, διαδραματίζουν περιοριστικό ρόλο στην πιθανότητα έκφρασης του γονιδίου, καθώς, όταν αυξήσουμε εξωγενώς της συγκέντρωσή τους, αυξάνουμε σημαντικά και το ποσοστό των κυττάρων, που τελικά αποκρίνονται στη μόλυνση με ιό. Η χαμηλή συγκέντρωση των παραγόντων αυτών, γεννά εύλογα ερωτήματα για τον τρόπο με τον οποίο, οι παράγοντες αυτοί, εντοπίζουν μέσα στο σχεδόν απέραντο «χάος» του γονιδιώματος και του τρισδιάστατου πυρήνα τις ειδικές θέσεις πρόσδεσής τους στα γονίδια-στόχους τους. Επικεντρωθήκαμε, κυρίως στην αποσαφήνιση του μηχανισμού που κατευθύνει αποτελεσματικά τον περιοριστικό παράγοντα NF-κΒ στα γονίδια στόχους, και κυρίως στην IFN-β, επειδή αφενός ο NF-κB αποτελεί τον πρώτο μεταγραφικό παράγοντα που πυροδοτεί τη δημιουργία του ενισχυοσώματος κι αφετέρου, επειδή έχουν βρεθεί εκατομμύρια πιθανές θέσεις πρόσδεσής του στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Διατυπώσαμε, λοιπόν, ως υπόθεση εργασίας ότι κάποιες από αυτές τις θέσεις πρόσδεσης έχουν ειδικό ρόλο στο να προσλαμβάνουν άμεσα τον NF-κB μετά την είσοδό του στον πυρήνα και να τον μεταφέρουν στα γονίδια- στόχους μέσω διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων. Εφαρμόζοντας μια σειρά, εξαιρετικά σύγχρονων κι εξειδικευμένων μοριακών τεχνικών, όπως 4C-ChIP και DNA FISH, ανακαλύψαμε και χαρακτηρίσαμε τρεις γενωμικές περιοχές σε διαφορετικά χρωμοσώματα, που αλληλεπιδρούν ειδικά με το γονίδιο της IFN-β μέσω NFκΒ. Όλες αυτές οι περιοχές, εντοπίζονται μακριά από γνωστά γονίδια, περιέχουν μια εξειδικευμένη θέση πρόσδεσης του NF-κΒ ως τμήμα επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας Alu κι είχαν άγνωστη μέχρι τώρα δράση. Τα πειράματά μας απέδειξαν ότι οι διαχρωμοσωμικές αυτές αλληλεπιδράσεις (στις οποίες λαμβάνει μέρος μόνο ένα αλληλόμορφο από κάθε γενωμική περιοχή) συμβαίνουν παροδικά, μόνο μετά τη μόλυνση με ιό, και κατά τη διάρκεια συγκρότησης του ενισχυοσώματος, ενώ μειώνονται κατά την έναρξη ή την επιμήκυνση της μεταγραφής. Προκειμένου, να μελετήσουμε άμεσα το ρόλο αυτών των αλληλεπιδράσεων στη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της IFN-β, εφαρμόσαμε την τεχνική RNA/DNA FISH, κατά την οποία αποκαλύψαμε ότι το γονίδιο της IFN-β, εκφράζεται όχι μόνο στοχαστικά, αλλά και μονο-αλληλικά, δηλαδή από ένα μόνο αλληλόμορφό της. Το εκπληκτικό αυτό αποτέλεσμα, αποκτά επιπρόσθετη βιολογική αξία από το γεγονός, ότι το μοναδικό μεταγραφικά ενεργό αλληλόμορφο της IFNβ είναι αυτό που βρίσκεται σε αλληλεπίδραση με -τουλάχιστον- μία από τις 3 προαναφερθείσες γενωμικές περιοχές. Είναι λογικό, λοιπόν, να υποθέσουμε ότι αύξηση της συχνότητας των διαχρωμοσωμικών αυτών αλληλεπιδράσεων συνεπάγεται κι αύξηση της πιθανότητας έκφρασης της IFN-β. Η υπόθεση αυτή, επαληθεύτηκε όταν διαμολύνοντας τα κύτταρα με πολλαπλά αντίγραφα καθεμιάς από τις τρεις γενωμικές περιοχές, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που εκφράζουν IFN-β, αλλά και των συνολικών επιπέδων του mRNA της IFN-β. Μάλιστα, διαπιστώθηκε ότι η δράση αυτή των πολλαπλών αντιγράφων στα επίπεδα έκφρασης της IFN-β, εξαρτάται άμεσα από την ειδική αλληλουχία πρόσδεσης του NF-κΒ. Το φαινόμενο αυτό ερμηνεύεται από το γεγονός ότι ο περιοριστικός παράγοντας NF-κΒ προσδένεται πρώτα στις γενωμικές περιοχές κι έπειτα μεταφέρεται στον ενισχυτή της IFN-β, όπως διαπιστώθηκε με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης σε χρωματίνη που απομονώθηκε από κύτταρα μολυσμένα με ιό για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Δεδομένου ότι οι εν λόγω γενωμικές περιοχές βρίσκονται σε φυσική εγγύτητα, ακόμη και πριν την είσοδο του NF-κΒ στον πυρήνα, ενδέχεται να αποτελούν ένα «κέντρο πρόσληψης του NF-κΒ», που είναι ικανό να προσελκύει άμεσα τον NF-κB και τον διανέμει στους υποκινητές επιλεγμένων γονιδίων μέσω διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων. Όμως, δεν είναι γνωστός ο μηχανισμός που εξασφαλίζει την άμεση πρόσδεση του NF-κΒ στο «κέντρο πρόσληψης του NF-κΒ», ούτε την εξειδίκευση των διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων, καθώς δεν στρατολογούνται όλα τα γονίδια που ρυθμίζονται από τον NF-κB (π.χ το IL-8) στο «κέντρο πρόσληψης». Μπορούμε να υποθέσουμε ότι το «κέντρο» εντοπίζεται σε εξειδικευμένες υποπυρηνικές περιοχές, στις οποίες ο NF-κB μπορεί να έχει άμεση πρόσβαση. Το μοντέλο αυτό ενισχύεται εν μέρει από το γεγονός ότι η συγγένεια του NF-κB για αυτές τις περιοχές είναι 2-3 φορές ασθενέστερη από αυτήν για το γονίδιο της IFN-β, υποδηλώνοντας ότι η προτίμησή του για το κέντρο «πρόσληψης» μπορεί να οφείλεται στην τοπική αρχιτεκτονική του πυρήνα, σε αλλοστερικές αλληλεπιδράσεις ή και σε άλλες πρωτεΐνες που εντοπίζονται σε αυτό το μικροπεριβάλλον. Επιπλέον, δεν γνωρίζουμε πλήρως τους μηχανισμούς που καθοδηγούν τις διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις κι εξασφαλίζουν την εξεδίκευσή τους. Τα μέχρι τώρα αποτελέσματά μας, αποκαλύπτουν ότι οι μετακινήσεις των γενωμικών περιοχών, προϋποθέτουν κατανάλωση ενέργειας με τη μορφή υδρόλυσης ATP κι επιπλέον, απαιτούν την παρουσία ορισμένων τροποποιητών της χρωματίνης, όπως της ακετυλ-τρανσφεράσης CBP/p300 και του συμπλόκου αναδόμηση της χρωματίνης SWI/SNF. Φυσικά, για την πλήρη διαλέυκανση του προβλήματος είναι αναγκαία επισταμένη έρευνα με χρήση μοριακών, βιοχημικών και κυτταρολογικών μεθόδων. Τα προηγούμενα πειράματα αποδεικνύουν ότι η στοχαστική μονοαλληλική έκφραση του γονιδίου της IFN-β ως απόκριση στη μόλυνση με ιό εξαρτάται από διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις του γονιδίου με τρεις διαγονιδιακές περιοχές. Οι αλληλεπιδράσεις συμβαίνουν μεταξύ ενός αλληλομόρφου της IFN-β, το οποίο επιλέγεται τυχαία (πιθανολογικά), κι ενός αλληλομόρφου οποιασδήποτε από τις γενωμικές περιοχές. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές επιτρέπουν την πρόσδεση του περιοριστικού μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ στον ενισχυτή του γονιδίου. O NF-κΒ με τη σειρά του ενορχηστρώνει τη συγκρότηση του ενισχυοσώματος σε αυτό το αλληλόμορφο κι οδηγεί στη μεταγραφική ενεργοποίησή του. Μελετώντας την έκφραση του γονιδίου της IFN-β σε μετέπειτα στάδια της ιικής μόλυνσης (8-10 ώρες μετά τον ιό), διαπιστώσαμε ότι η παραγωγή της IFN-β ενισχύεται σημαντικά, γεγονός που οφείλεται αφενός στην αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που εκφράζουν το εν λόγω γονίδιο, κι αφετέρου στη αύξηση των μεταγραφικά ενεργών αλληλομόρφων ανά κύτταρο. Η σταδιακή μετατροπή της μονο-αλληλικής έκφρασης σε πολυ-αλληλική είναι ανεξάρτητη από διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις. Για να διερευνήσουμε τον υπεύθυνο μηχανισμό, εξετάσαμε πρώτα από όλα το ενδεχόμενο θετικής αυτοτροφοδότησης από την εκκρινόμενη πρωτεϊνη IFN-β. Τα πειράματά μας, επιβεβαίωσαν αυτή την υπόθεση, καθώς απέδειξαν ότι η αρχικά μονο-αλληλικά παραγόμενη IFN-β, μέσω του μονοπατιού μεταγωγής σήματος, και ειδικά μέσω επαγωγής του γονιδίου του παράγοντα IRF-7 προάγει την ενεργοποίηση επιπρόσθετων αλληλομόρφων και σε περισσότερα κύτταρα. Υπενθυμίζεται ότι ο IRF-7, αποτελεί έναν ακόμη περιοριστικό μεταγραφικό παράγοντα του γονιδίου της IFN-β. Επομένως, η άυξηση της ενδοκυτταρικής του συγκέντρωσης, πιθανότατα, εξασφαλίζει την σύνδεσή του στον υποκινητή των αλληλομόρφων, που δεν εξέφραζαν αρχικώς την IFN-β, όπου οργανώνει τη συγκρότηση του ενισχυοσώματος σε αυτά, προκαλώντας έτσι ένα δεύτερο κύμα παραγωγής IFN-β από περισσότερα κύτταρα και περισσότερα αλληλόμορφα ανά κύτταρο. Συνοψίζοντας, στην παρούσα μελέτη, παρουσιάζουμε ισχυρές ενδείξεις για ένα μοντέλο διφασικής έκφρασης του γονιδίου της IFN-β. Σύμφωνα με αυτό, η μόλυνση με ιό προκαλεί αρχικά τη στοχαστική έκφραση του γονιδίου της IFN-β σε ένα αλληλόμορφο και σε ένα μικρό πληθυσμό κυττάρων. Η επιλογή του αλληλομόρφου της IFN-β, που πρόκειται να εκφραστεί, εξαρτάται από δια-χρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις με τις τρεις διακριτέ γενωμικές περιοχές που ταυτοποιήσαμε. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές διαμεσολαβούν για την πρόσδεση του περιοριστικού μεταγραφικού παράγοντα NF-κB στον ενισχυτή της IFN-β προάγοντας την συγκρότηση του ενισχυοσώματος και την ενεργοποίηση της μεταγραφής από το συγκεκριμένο αλληλόμορφο. Η εκκρινόμενη IFN-β προκαλεί υψηλά επίπεδα έκφρασης του παράγοντα IRF-7, ο οποίος με τη σειρά του επάγει την συγκρότηση του ενισχυοσώματος και τη μεταγραφή της IFN-β από τα υπόλοιπα αλληλόμορφα και σε κύτταρα που δεν εξέφραζαν αρχικά. Επομένως, ο ενισχυτής της IFN-β λειτουργεί με έναν μη-γραμμικό τρόπο κι ενισχύοντας εξωκυτταρικά σήματα. Στην παρούσα μελέτη γίνεται σαφές ότι η πιθανότητα έκφρασης του γονιδίου της IFN-β είναι δυνατόν να αυξηθεί τεχνητά με δύο διαφορετικούς τρόπους. Ο πρώτος βασίζεται στην άμεση αύξηση της συγκέντρωσης ενός από τους περιοριστικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Στην περίπτωση αυτή, ο άφθονος πλέον παράγοντας έχει πολύ μεγάλη πιθανότητα να προσεγγίσει τον ενισχυτή οποιουδήποτε αλληλομόρφου σχεδόν σε όλα τα κύτταρα. Η πρόσδεσή του θα προσελκύσει συνεργατικά και τους υπόλοιπους παράγοντες, προκειμένου να συγκροτηθεί ένα λειτουργικό ενισχυόσωμα που θα εξασφαλίσει τη μεταγραφή του γονιδίου από πολλάπλά αλληλόμορφα σε πολλά κύτταρα. Ο δεύτερος τρόπος έγκειται στο ρόλο των διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων. Είναι η πρώτη φορά που αποκαλύπτεται ότι αυξάνοντας τα αντίγραφα μιας γενωμικής περιοχής (και μάλιστα μη κωδικής) που έχει τη δυνατότητα άμεσης πρόσληψης και διανομής ενός μεταγραφικού παράγοντα χαμηλής συγκέντρωσης, αυξάνεται η πιθανότητα έκφρασης του γονιδίουστόχου του. Αξιοσημείωτο, είναι ότι με την κατασκευή σταθερών κυτταρικών σειρών με πολλαπλά αντίγραφα μιας τέτοιας γενωμικής περιοχής επιτύχαμε: 1. αυξημένα επίπεδα έκφρασης της IFN-β, 2. πρόωρη και πιο άμεση απόκριση στην ιική μόλυνση και τέλος, 3. υψηλή ευαισθητοποίηση των κυττάρων, τα οποία καθίστανται ικανά να αποκρίνονται ακόμη και σε πολύ χαμηλούς τίτλους ιού.