Μηχανισμός δράσης μεταγραφικών ενισχυτών

Abstract

The accurate execution of gene expression programs during development, differentiation and in response to environmental cues requires three types of regulatory DNA elements in higher eukaryotes: core promoters, upstream promoter elements and enhancers. Core promoters function by providing the blueprints for the assembly of functional preinitiation complexes executing both the mechanics and the accurate initiation of mRNA synthesis. Upstream promoter elements are localized within the first 100-200 bp upstream of the core promoter and contain transcription factor binding sites, functioning to increase the rate of transcription by promoting preinitiation complex assembly. Enhancers on the other hand, can be located either upstream or downstream of the promoter, on the same or on different chromosomes. Enhancer elements do not simply fine-tune promoter activity, but rather are critical for defining the expression patterns of genes. The distinction between enhancers and upstream promoter elements is rather operational, since many upstream promoter elements can function as enhancers and vice versa. This is not a surprising result, since transcription factors bound to enhancers are also bound to upstream regulatory elements. Recent studies have shown that gene activation by remote enhancers is associated with long range interactions between regulatory elements (chromatin loop formation). It is hypothesized that proteins bound to remote enhancers directly interact with proteins bound to promoters with the intervening DNA being looped out. Furthermore, it has also been proposed that enhancer complexes migrate along the chromatin fiber until they encounter a functional promoter (facilitated tracking model). The intervening chromatin between the enhancer and the promoter loops out as the enhancer complex progressively moves along the chromatin fiber towards the promoter. The physical proximity between the enhancer and the target promoter stimulates assembly of a functional preinitiation complex on the promoter, thus causing activation of transcription. Interestingly, some studies suggest that PolII is recruited to the enhancers and then via DNA looping and/or facilitated tracking appears on the promoter. The molecular basis for DNA looping is not yet clear, although interactions between structural proteins, transcription factors or general transcription factors within transcription factories have been implicated in enhancer-promoter interactions. However, we do not know how these interactions are established and maintained in molecular terms. In this paper we have investigated the mechanisms by which a remote enhancer reaches a target promoter. In other words, are the transcription factors bound to enhancers and promoters the ones that provide the contact surfaces for these interactions? Here we have addressed these questions by examining how the IFN-β enhancer activates transcription when positioned away from its promoter. Although, the natural IFN-β enhancer is located immediately upstream of the core promoter, it can also function as a classical enhancer element conferring virus inducibility to heterologous promoters, even when it is placed several kilobases away from these promoters. The nearly complete molecular picture of the mechanisms by which the IFN-β enhancer activates transcription in its natural context, provided us a useful tool to investigate the nature of the interactions between enhancers and promoters. Our experiments suggest that sequence-specific transcription factors bound to enhancers and promoters mediate loop formation and can thus explain the specificity observed in enhancer-promoter interactions, especially in complex genetic loci. In this study, we used simple synthetic enhancers to answer important questions related to the mechanisms by which enhancers activate transcription from a distance. Although some previous studies have suggested that transcription factors mediate the interactions between enhancers and promoters, a significant number of important questions have remained elusive. First, we asked whether enhancer action from distance depends on transcription factor binding sites present at the target promoter and whether this dependence controls DNA looping. Furthermore, we addressed whether these transcription factor binding sites serve as “docking” sites for interactions with remote enhancers and whether they can work as decoys when placed at irrelevant positions. We also tested whether heterolologous DNA binding proteins capable of DNA looping can substitute for transcription factors in mediating enhancer-promoter interactions. Thus, depending on the answers to these questions, it would be possible to draw rules regarding the mechanisms by which enhancers identify the target promoters. To address these points, we generated synthetic enhancer-promoter configurations by placing the IFN- β enhancer at increasing distances from the core promoter. Remarkably, the ability of the enhancer to activate the promoter was lost when the enhancer was placed more than 560 bp away from the promoter because it couldn’t loop out to reach it. DNA looping and transcriptional activity were restored when a heterologous transcription factor binding site (Sp1) was inserted at the promoter. These experiments suggested that enhancer binding proteins and/or their associated coactivators establish a productive interaction with target promoters using promoter-bound transcription factors. These protein-protein interactions between transcription factors could drive DNA loop formation and are independent of ongoing transcription. We showed that the transcriptionally inert p50 homodimer bound to the promoter can mediate efficient enhancer-promoter interactions supporting activation of transcription by the remote enhancer. Additional evidence was provided when we replaced the promoter transcription factor binding sites with λ repressor sites. The λ repressor, a prokaryotic protein incapable of activating transcription on its own in mammalian cells, can establish enhancer-promoter interactions when its binding sites were placed in both elements. Most likely, the λ repressor binds to both sites (at the enhancer and the promoter) and generates a DNA loop due to the formation of large protein complexes in which individual repressors bound to the different sites interact with each other. Thus, the forces driving loop formation appear to be protein-protein interactions between widely separated transcription factors. A prediction derived from this idea is that enhancers could be trapped away from target promoters by transcription factors scattered throughout the genome. Indeed, we showed that insertion of a single transcription factor binding site between the IFN- β enhancer and the target promoter captured the enhancer on this site and not on the target promoter. An implication derived from this observation is that enhancers at their physiological context could work from a distance by establishing sequential interactions (loops) with genomic sites bearing transcription factors binding elements until they reach a fully functional promoter. Such a model can explain why these loops are dynamic and how preferences in enhancer-promoter interactions are established. We can imagine that the specificity in enhancer-promoter interactions depends on the strength of the interactions between transcription factors bound to these elements. Since enhancer and promoter bound transcription factors form higher order nucleoprotein complexes, the looped structures should be formed and stabilized by protein-protein interactions between continuous surfaces formed by the higher order nucleoprotein assemblies, thus providing the necessary specificity. This idea can also explain the function of promoter tethering elements that can selectively interact with enhancers during Drosophila development, thus regulating enhancer-promoter interactions at complex genetic loci. This model can also explain the functional interaction between enhancers and promoters located on non-homologous chromosomes, like the olfactory receptor genes. A particular enhancer termed H can contact promoters located on the same or on different chromosomes. These interactions are monoallelic and have been proposed to explain the expression of a single olfactory receptor gene per neuron. Ordinarily, the probability of enhancer-promoter interactions and loop formation should depend on the occupancy of the sites by the cognate transcription factors, the distance between the interacting elements and the flexibility of the looped chromatin. Therefore, we imagine that enhancers and promoters bound by high affinity and/or abundant transcription factors are more likely to establish functional chromatin loops, than regulatory elements bound by low abundance and/or low affinity transcription factors. Furthermore, the shorter the distance between an enhancer and a promoter, the greater the probability for a productive interaction, an observation confirmed by our data. Finally, the recruitment of chromatin modifiers and remodelers to the enhancers and promoters by transcription factors can alter the biophysical properties of the surrounding chromatin, thus facilitating DNA looping.

Η ακριβής εκτέλεση των ποικίλων προγραµµάτων γονιδιακής έκφρασης κατά την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση ή/και ως απόκριση σε περιβαλλοντικά ερεθίσµατα απαιτεί τη συνδυασµένη δράση τριών ρυθµιστικών στοιχείων του DNA: των κεντρικών υποκινητών, των ρυθµιστικών στοιχείων που βρίσκονται ανοδικά του υποκινητή και των ενισχυτών. Οι κεντρικοί υποκινητές λειτουργούν ως τα προσχέδια για τη συγκρότηση λειτουργικών προεναρκτηρίων συµπλόκων, τα οποία συµµετέχουν στο µηχανισµό έναρξης της µεταγραφής και ελέγχουν λεπτοµερώς την έναρξη της σύνθεσης του mRNA. Τα ρυθµιστικά στοιχεία που βρίσκονται ανοδικά του υποκινητή εντοπίζονται 100 µε 200 bp ανοδικά του κεντρικού υποκινητή και περιέχουν θέσεις πρόσδεσης για µεταγραφικούς παράγοντες, µέσα από τη δράση των οποίων ενισχύεται ο σχηµατισµός λειτουργικών προεναρκτήριων συµπλόκων και τελικά αυξάνεται ο ρυθµός της µεταγραφής. Οι ενισχυτές από την άλλη µπορούν να εντοπίζονται είτε ανοδικά είτε καθοδικά του υποκινητή πάνω στο ίδιο ή σε διαφορετικά χρωµοσώµατα. Οι ενισχυτές δεν ρυθµίζουν µόνο τη δράση των υποκινητών, αλλά η δράση τους είναι σηµαντική για τον προσδιορισµό διαφόρων προτύπων έκφρασης οµάδων γονιδίων. Η διάκριση ανάµεσα σε ενισχυτές και σε ρυθµιστικά στοιχεία, που εντοπίζονται ανοδικά του υποκινητή, είναι κυρίως τυπική, αφού αρκετά ανοδικά ρυθµιστικά στοιχεία υποκινητών µπορούν να δράσουν ως ενισχυτές, και το αντίστροφο. Προς αυτήν την κατεύθυνση συνηγορεί και το γεγονός ότι η πλειοψηφία των µεταγραφικών παραγόντων, που προσδένονται στους ενισχυτές, προσδένονται συνήθως και σε ανοδικά ρυθµιστικά στοιχεία. Πρόσφατες µελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση ενός γονιδίου από έναν µακρινό ενισχυτή συνοδεύεται από το σχηµατισµό θηλιών πάνω στην χρωµατίνη. Υποτίθεται ότι οι πρωτεΐνες, οι οποίες είναι προσδεµένες στους µακρινούς ενισχυτές, αλληλεπιδρούν µε πρωτεΐνες, που εντοπίζονται προσδεµένες στους υποκινητές, µε το παρεµβαλλόµενο DNA να αποµακρύνεται µε τη µορφή βρόγχου. Επιπρόσθετα έχει προταθεί ότι τα πρωτεϊνικά σύµπλοκα που συγκροτούνται επάνω στον ενισχυτή µετακινούνται κατά µήκος της χρωµατινικής ίνας, µέχρι να συναντήσουν έναν λειτουργικό υποκινητή (µοντέλο διευκολυνόµενης µετάβασης). Καθώς το πρωτεϊνικό σύµπλοκο, που σχηµατίζεται στον ενισχυτή, κινείται κατά µήκος της χρωµατινικής ίνας προς τον υποκινητή, η χρωµατίνη που υπάρχει ανάµεσα στον υποκινητή και στον ενισχυτή αποµακρύνεται µε το σχηµατισµό βρόγχου. Όταν ο ενισχυτής πλησιάσει τον υποκινητή του γονιδίου στόχου, τότε διεγείρεται ο σχηµατισµός ενός λειτουργικού προεναρκτηρίου συµπλόκου στον υποκινητή, οδηγώντας στην ενεργοποίηση της µεταγραφής. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι παρατηρήσεις που έχουν γίνει σε µερικές µελέτες όπου φαίνεται ότι η RNA πολυµεράση ΙΙ στρατολογείται πρώτα στους ενισχυτές και στη συνέχεια, αφού σχηµατιστεί ο βρόγχος πάνω στο DNA, µετακινείται και τελικά εµφανίζεται και επάνω στον υποκινητή. Λεπτοµέρειες που αφορούν τη µοριακή βάση του σχηµατισµού του βρόγχου πάνω στο DNA δεν υπάρχουν, παρόλο που αλληλοεπιδράσεις µεταξύ δοµικών πρωτεϊνών, µεταγραφικών παραγόντων και γενικών µεταγραφικών παραγόντων µέσα στα «εργοστάσια» της µεταγραφής εµπλέκονται στην επικοινωνία ανάµεσα στον ενισχυτή και στον υποκινητή. Η συµµετοχή µεταγραφικών παραγόντων, που προσδένονται ειδικά στους ενισχυτές και στους υποκινητές, στο σχηµατισµό βρόγχων πάνω στο DNA θα µπορούσε να εξηγήσει τις ειδικές αλληλοεπιδράσεις ενισχυτών-υποκινητών, ιδιαίτερα µέσα σε πολύπλοκες γενετικά περιοχές. Σε αυτήν την εργασία διερευνάτε ο µηχανισµός µε τον οποίο ένας αποµακρυσµένος ενισχυτής βρίσκει τον υποκινητή στόχο. Είναι σηµαντικό να τονιστεί ότι ακόµα δεν γνωρίζουµε τον τρόπο που αυτές οι αλληλοεπιδράσεις δηµιουργούνται και διατηρούνται σε µοριακό επίπεδο. Με άλλα λόγια είναι οι µεταγραφικοί παράγοντες, που προσδένονται στους ενισχυτές και στους υποκινητές παρέχοντας τις επιφάνειες επαφής για αυτές τις αλληλοεπιδράσεις, ή είναι τα µόρια των συνενεργοποιητών, που στρατολογούνται από τους µεταγραφικούς παράγοντες, οι οποίοι λειτουργούν ως µια µοριακή γέφυρα, που φέρνει κοντά αυτά τα DNA ρυθµιστικά στοιχεία, που είναι ιδιαίτερα αποµακρυσµένα µεταξύ τους. Προσπαθήσαµε να απαντήσουµε στα παραπάνω ερωτήματα εξετάζοντας τον τρόπο µε τον οποίο ο ενισχυτής του γονιδίου της IFN-β ενεργοποιεί τη µεταγραφή από απόσταση, όταν αυτός τοποθετείται µακριά από τον υποκινητή του γονιδίου. Μολονότι ο ενισχυτής της IFN-β εντοπίζεται αµέσως πάνω από τον κεντρικό υποκινητή του γονιδίου φυσικού τύπου, µπορεί επίσης να δράσει ως κλασσικός ενισχυτής προσδίδοντας ιική επαγωγιµότητα σε ετερόλογους υποκινητές, ακόµα και όταν είναι τοποθετηµένος πολλές χιλιάδες βάσεις µακριά από αυτούς τους υποκινητές. Η ολοκληρωµένη εικόνα του µοριακού µηχανισµού, µέσω του οποίου ο ενισχυτής της IFN-β ενεργοποιεί τη µεταγραφή του γονιδίου φυσικού τύπου, µας επιτρέπει να χρησιµοποιήσουµε τον ενισχυτή του γονιδίου αυτού για να µελετήσουµε τη φύση των αλληλοεπιδράσεων ανάµεσα στους ενισχυτές και στους υποκινητές. Σε αυτήν την εργασία χρησιµοποιήθηκε ένας απλός συνθετικός ενισχυτής για να απαντηθούν ορισµένα σηµαντικά ερωτήµατα που σχετίζονται µε τον µηχανισµό δράσης των ενισχυτών από απόσταση. Αν και κάποιες προηγούµενες εργασίες προτείνουν ότι οι µεταγραφικοί παράγοντες µεσολαβούν για την αλληλοεπίδραση µεταξύ των ενισχυτών και των υποκινητών, ένας σηµαντικός αριθµός ερωτηµάτων παραµένει αναπάντητος. Πρώτα από όλα προσπαθήσαµε να απαντήσουµε στο ερώτηµα κατά πόσο η δράση του ενισχυτή από απόσταση εξαρτάται από την παρουσία θέσεων πρόσδεσης στον υποκινητή στόχο και κατά πόσο αυτού του είδους η εξάρτηση ελέγχει το σχηµατισµό βρόγχων πάνω στο DNA. Επιπλέον απαντήσαµε στο ερώτηµα κατά πόσο αυτές οι θέσεις πρόσδεσης για τους µεταγραφικούς παράγοντες λειτουργούν ως θέσεις «αγκυροβόλησης» για την αλληλοεπίδραση µε τους µακρινούς ενισχυτές και κατά πόσο µπορούν να «παρασύρουν» τους ενισχυτές, όταν τοποθετούνται σε διάφορες άλλες θέσεις ανάµεσα στον ενισχυτή και στον υποκινητή. Επίσης εξετάσαµε κατά πόσο ετερόλογες πρωτεΐνες, που προσδένονται πάνω στο DNA και που έχουν την ικανότητα προκαλούν τη δηµιουργία βρόγχων πάνω στο DNA, µπορούν να αντικαταστήσουν τους µεταγραφικούς παράγοντες, µεσολαβώντας, αντί των µεταγραφικών παραγόντων, στις αλληλοεπιδράσεις ανάµεσα στον ενισχυτή και στον υποκινητή. Συνεπώς συνδυάζοντας τις απαντήσεις που δόθηκαν σε αυτά τα ερωτήµατα, θα µπορέσουµε να δηµιουργήσουµε µια ολοκληρωµένη εικόνα σχετικά µε το µηχανισµό µε τον οποίο οι ενισχυτές αναγνωρίζουν τα γονίδια στόχους. Για να απαντήσουµε στα παραπάνω ερωτήµατα συνθέσαµε πλασµιδιακές κατασκευές που περιέχουν ενισχυτές και υποκινητές σε διάφορες διατάξεις, τοποθετώντας τον ενισχυτή της IFN-β σε θέσεις αυξανόµενης απόστασης από τον κεντρικό υποκινητή. Αξιοσηµείωτη είναι η παρατήρηση ότι η ικανότητα του ενισχυτή να ενεργοποιεί τη µεταγραφή χάθηκε, όταν ο ενισχυτής τοποθετήθηκε σε απόσταση µεγαλύτερη από 560 bp από τον υποκινητή, επειδή δεν µπορούσε να προκαλέσει το σχηµατισµό κάποιου βρόγχου, ώστε να φτάσει τον υποκινητή. Η δηµιουργία βρόγχου πάνω στο DNA και η ενεργοποίηση της µεταγραφής αποκαταστάθηκαν, όταν εισάγαµε µια ετερόλογη θέση πρόσδεσης για µεταγραφικούς παράγοντες (SP1) στον υποκινητή. Aυτά τα πειράµατα προτείνουν ότι οι πρωτεΐνες που προσδένονται στον ενισχυτή και/ή οι συνενεργοποιητές που στρατολογούνται δηµιουργούν λειτουργικές αλληλοεπιδράσεις µε τους υποκινητές στόχους, χρησιµοποιώντας για αυτή τη δράση τους µεταγραφικούς παράγοντες που δένονται στον υποκινητή. Αυτές οι πρωτεϊνικές αλληλοεπιδράσεις µεταξύ των µεταγραφικών παραγόντων µπορούν να οδηγήσουν στο σχηµατισµό βρόγχων πάνω στο DNA και είναι ανεξάρτητες της ongoing transcription. ∆είξαµε ότι το µεταγραφικά αδρανές p50 οµοδιµερές, όταν είναι προσδεµένο στον υποκινητή, µπορεί να µεσολαβήσει για την επαρκή αλληλοεπίδραση του ενισχυτή µε τον υποκινητή, επιτρέποντας την ενεργοποίηση της µεταγραφής από τον µακρινό ενισχυτή. Επιπρόσθετα στοιχεία προέκυψαν, όταν αντικαταστήσαµε τις θέσεις πρόσδεσης των µεταγραφικών παραγόντων που δένονται στον υποκινητή µε θέσεις πρόσδεσης του λ καταστολέα. Ο λ καταστολέας, µια προκαρυωτική πρωτεΐνη που από µόνη της δεν µπορεί να ενεργοποιήσει τη µεταγραφή στα κύτταρα των θηλαστικών, µπορεί να αποκαταστήσει την επικοινωνία του ενισχυτή µε τον υποκινητή, όταν οι θέσεις πρόσδεσης του καταστολέα τοποθετηθούν ανοδικά των δύο ρυθµιστικών στοιχείων. Πιστεύουµε ότι ο καταστολέας λ προσδένεται ταυτόχρονα και στις δύο θέσεις (τόσο στον ενισχυτή όσο και στον υποκινητή) και δηµιουργεί βρόγχο πάνω στο DNA, και αυτό συµβαίνει γιατί σχηµατίζονται µεγάλα πρωτεϊνικά σύµπλοκα µέσα στο οποία τα µόρια του καταστολέα, που δένονται σε διαφορετικές θέσεις, αλληλοεπιδρούν µεταξύ τους. Συνεπώς η οδηγός δύναµη για το σχηµατισµό βρόγχων πάνω στη χρωµατίνη είναι οι πρωτεϊνικές αλληλοεπιδράσεις ανάµεσα στους διάσπαρτους πάνω στο γένωµα µεταγραφικούς παράγοντες. Μια πρόβλεψη που πηγάζει από την ιδέα αυτή είναι ότι οι ενισχυτές µπορούν να παγιδευτούν µακριά από τους υποκινητές στόχους από θέσεις πρόσδεσης µεταγραφικών παραγόντων που είναι διάσπαρτες µέσα στο γένωµα. Πραγµατικά δείξαµε ότι εισάγοντας µια µόνο θέση πρόσδεσης για τον ενεργοποιητή SP1, ανάµεσα στον ενισχυτή της IFN-β και του υποκινητή στόχου, καταφέραµε να παγιδέψουµε τον ενισχυτή σε αυτή τη θέση, εµποδίζοντας τον να φτάσει στον υποκινητή στόχο. Η παρατήρηση αυτή θα µπορούσε να ερµηνεύσει τον τρόπο δράσης των ενισχυτών από απόσταση µε τη δηµιουργία διαδοχικών βρόγχων µε γενωµικές θέσεις που φέρουν ακολουθίες πρόσδεσης για µεταγραφικούς παράγοντες, µέχρι να συναντήσουν κάποιο λειτουργικό ενισχυτή. Ένα τέτοιο µοντέλο θα µπορούσε να εξηγήσει τη δυναµική φύση αυτών των βρόγχων και τον τρόπο µε τον οποίο επιλέγει ένας ενισχυτή έναν υποκινητή για να αλληλοεπιδράσουν. Μπορούµε να φανταστούµε ότι η ειδικότητα των αλληλοεπιδράσεων αυτών των δύο ρυθµιστικών στοιχείων εξαρτάται από την ισχύ των αλληλοεπιδράσεων των µεταγραφικών παραγόντων που προσδένονται σε αυτά τα δύο στοιχεία. Μιας και οι µεταγραφικοί παράγοντες που δένονται στον ενισχυτή και στον υποκινητή σχηµατίζουν νουκλεοπρωτεϊνικά σύµπλοκα υψηλότερης δοµής και οργάνωσης, οι βρόγχοι θα πρέπει να σχηµατίζονται και να σταθεροποιούνται από πρωτεϊνικές αλληλοεπιδράσεις ανάµεσα σε συνεχείς επιφάνειες που σχηµατίζονται από αυτές τις νουκλεοπρωτεϊνικές δοµές υψηλότερης οργάνωσης, εξασφαλίζοντας µε τον τρόπο αυτό την απαιτούµενη ειδικότητα. Αυτή η ιδέα µπορεί επίσης να εξηγήσει τη δράση κάποιων ρυθµιστικών στοιχείων του υποκινητή που µπορούν να «δέσουν» επιλεκτικά κάποιον ενισχυτή κατά την ανάπτυξη της Drosophila, ρυθµίζοντας µε τον τρόπο αυτό τις αλληλοεπιδράσεις ανάµεσα στους ενισχυτές και στους υποκινητές σε πολύπλοκες γενετικά περιοχές. Αυτό το µοντέλο µπορεί επίσης να εξηγήσει τη λειτουργική αλληλοεπίδραση µεταξύ ενισχυτών και υποκινητών που εντοπίζονται σε µη οµόλογα χρωµοσώµατα, όπως συµβαίνει στην περίπτωση των γονιδίων των οσφρητικών υποδοχέων. Ένας ενισχυτή, ο οποίος ονοµάζεται Η, µπορεί να έλθει σε επαφή µε υποκινητές που βρίσκονται πάνω στο ίδιο ή και σε διαφορετικά χρωµοσώµατα. Αυτές οι αλληλοεπιδράσεις είναι µονοαλληλικές και έχει προταθεί ότι ερµηνεύουν το παράδοξο της έκφρασης ενός µόνο γονιδίου των οσφρητικών υποδοχέων σε κάθε νευρώνα. Η πιθανότητα ενός µακρινού ενισχυτή να αλληλοεπιδράσει µε έναν υποκινητή και να σχηµατιστεί βρόγχος πάνω στο DNA θα εξαρτηθεί από την κατάληψη των ειδικών θέσεων πρόσδεσης από τους συγγενείς µεταγραφικούς παράγοντες, από την απόσταση των αλληλοεπιδρώντων ενισχυτών και υποκινητών και από την ελαστικότητα της χρωµατίνης. Για αυτό πιστεύουµε ότι εκείνοι οι ενισχυτές και οι υποκινητές που προσδένονται από υψηλής συγγένειας και/ή από άφθονους µεταγραφικούς παράγοντες µπορούν να σχηµατίσουν λειτουργικούς βρόγχους πάνω στη χρωµατίνη, και όχι εκείνα τα cis ρυθµιστικά στοιχεία που καταλαµβάνονται από µη άφθονους και/ή από χαµηλής συγγένειας µεταγραφικούς παράγοντες. Επιπρόσθετα όσο πιο κοντινή είναι η απόσταση ανάµεσα στον ενισχυτή και στον υποκινητή τόσο µεγαλύτερη είναι η πιθανότητα για λειτουργική αλληλοεπίδραση, µια παρατήρηση που επιβεβαιώνεται από τα δικά µας αποτελέσµατα. Τέλος, µε τη στρατολόγηση, από τους µεταγραφικούς παράγοντες, πρωτεϊνών, που τροποποιούν τη χρωµατίνη και που αναδοµούν τα νουκλεοσώµατα, στους ενισχυτές και στους υποκινητές µπορούν να αλλάξουν οι βιοφυσικές ιδιότητες της περιβάλλουσας χρωµατίνης, βοηθώντας µε τον τρόπο αυτό το σχηµατισµό βρόγχων πάνω στο DNA.