Ανάπτυξη εξειδικευμένων μικροσυστοιχιών DNA για την ανάλυση της δραστικότητας του NF-kB σε ανθρώπινα λεμφώματα

Abstract

Key event in antiviral response in humans is the transcriptional activation and the production of type I interferons by the infected cells. Previous studies in our lab have clearly described how this transcriptional activation is achieved for the IFN-β gene. Important aspects of this process are the stochasticity of gene expression through interchromosomal interactions and monoallelic gene expression. The main purpose of this thesis is to describe the mechanism by which the process of antiviral response is orchestrated in the context of the three-dimensional space of the nucleus. It is known from previous work that after viral infection, the transcription factor NF-κB is activated and enters the nucleus. This transcription factor appears to have ~106 binding sites in the human genome, some of high and others of low affinity. The number of genes known to be regulated by its, is estimated at about 500. The question that immediately arises is how this transcription factor is able to identify the binding sites of genes to be regulated depending on the stimulus. In this thesis, we firstly deal with a particular group of DNA elements containing binding sites for NF-κB, but adjacent to Alu repetitive elements. These positions differ to some degree from the typical (consensus) sequences that NF-κB binds and are usually located away from promoter/enhancer regions. Studies in our laboratory have shown that most binding sites (not just possible, but those identified as functional) cannot correlate with transcriptional activation. It is obvious that we need to investigate the role played by this large number of binding sites in the human genome. In our effort, we identified a new type of binding site of this transcription factor that contains Alu elements and exists in multiple copies. The members of this group do not in any way share common functional characteristics, in relation to transcriptional activation. Our studies showed that some of these elements, acted as distributors of transcription factors in setting positions in the genome. Major concern of this study is to identify the targets of NF-KB in the human genome. Using modern technology, we can map the way by which binding events are distributed throughout the genome after infection with Sendai virus and thus we observed a wide dispersion of these elements, having though different characteristics. The analysis of specific binding events and sequences of binding sites obtained, revealed a new binding element, the characteristics of which were described previously. This element is named Alu-κB and its existence and significance were before this work largely unknown. The members of this family were found to have different properties, different distribution in the genome, different preferences as to the chromatin environment and different contribution to transcriptional activity. We studied the distribution of specific binding sites in the genome and especially to each chromosome, as well as the specific role that these positions seem to have in humans, which was made clear by analyzing similar sites in mouse. These positions are bound by NF-κB in most cases after viral infection, but in some even before. Also, some members of this family seem to have the ability to recruit the architectural protein HMG(I)Y or respond by binding of NF-κB to other stimuli except of the virus, such as TNF-α. In addition, some of them can be bound by NF-KB or other subunits of the same family in cell lines, infected by another type of virus (EBV). An extensive analysis of these sites’ affinity with the transcription factor in vitro demonstrated that the members belonging to Alu-κB family, show variety even in this aspect. We furthermore studied indicatively the transcriptional activity of some of these elements with the use of in vitro transcription systems and the capability of transcriptional activation of these elements, their function in artificial promoters and then measuring the transcriptional activity. In both cases, the properties vary as there are elements that have strong capacity for transcriptional activation and others that show no such features. Finally, using DNA FISH technology we showed that some members of this family take part in interchromosomal interactions resulting in enhanced transcriptional activation of specific genes, while other elements, bearing high sequence similarity to the previous, lack of such characteristics. Based on these findings, we wanted to focus on the properties of these elements of the Alu-KB family that are able to participate in interchromosomal interactions and to enhance thereby the transcriptional activation of genes. From previous research, we know that specific DNA elements form dynamic structures called NRCs (NF-κB Receptor Centers). Next step in the study is to isolate and study in depth the key genes that participate in antiviral response. Our aim is to study genes regulated by NF-κB through NRCs. With exploitation of DNA microarray technology, we were able to identify such genes, some of them -based on their gene ontology- are very important components of the immune defense of the cell. We chose to study in depth genes that are not induced as a secondary effect from the production of IFN-β but virus-induced, regulated by NF-κB and through the elements of NRCs. Based on this assumption, we prove in this study that the genomic regions of these genes come in contact through interchromosomal interactions with the NRCs, after viral infection. In the next step, we show that the expression of these genes is observed in only some cells, while all cells of population are infected by virus. The expression of these genes therefore is characterized as stochastic and we specifically demonstrate in our experiments that these genes are expressed only by one allele. The most important finding of this part of the study is that the allele which produces transcripts for each gene we are studying is identical with the allele of the gene that interacts with NRCs. That is, if we study each gene in isolation but in relation to the NRCs, we observe the production of transcripts from one allele involved in one interaction with the NRCs. Key question of this thesis is the behavior of each cell within the population. So far our studies were limited to interactions that occur in three-dimensional space of the nucleus of every cell. By analyzing the expression of each gene in the population level, we showed that there were differences in expression levels and time motive from gene to gene. We wondered whether the cells that are involved in antiviral response express only one of the genes that are required or if they decide to finally express the complete set of genes of defense against viruses. Do we observe overlapping populations of cells expressing different genes or a fraction of the population that expresses all the necessary genes? We answer this question with in situ hybridization experiments and studies of gene expression at the level of single cell and found that the second case is the answer. We also confirmed differences in the time pattern of gene expression. We finally assumed that there are two groups of genes according to the time pattern of expression, the early and late. The cell expressing one or more of the early genes increases the possibility to express the full set of genes at a later stage or we hypothesize that it seems to take a decision on the "fate" to be one of the cells that participate in antiviral response. In order to study exactly what happens in the cell nucleus and the key structures of the process after virus infection, in the dimensions of space and time, we analyzed the system globally. Initially, we marked all regions simultaneously but in different way, regulated regions and regulators. We observed that the structures of NRCs preexist of viral infection, but build up to a greater extent after that. The regions of genes to be expressed at later time points, take part in interactions with NRCs. The result of previously described data is to observe multiple interactions in each cell between different genes and NRCs and create new questions as to the functional specialization of NRCs. In the next step, we labeled with a different mark the three elements that are known to consist NRCs and analyzed the properties and characteristics of formation of these structures from the time before the infection until 4 hours later, where most of interchromosomal interactions have already taken place. This analysis was particularly enlightening. In the last part of this study, we added two new prospects in the direction of our research. At first, knowing that the process of antiviral response is much more complex than what is described through our studies so far, we used modern technologies (4C chip), in order to map the totality of possible interactions of NRCs, with new areas, regulators or not, in the cell nucleus before and after infection with virus. These experiments led to a huge volume of information, which we exploit in order to represent more clearly the movements of DNA elements in the nucleus. Finally, we gave special consideration to the mechanism which comprises the driving force of interchromosomal interactions, suggesting molecules and chemical processes that take part and ultimately proposing a comprehensive model of what happens in the nucleus of a cell that is infected by virus.

Κεντρικό γεγονός στην αντιϊική απόκριση στους ανθρώπους λαμβάνει η μεταγραφική ενεργοποίηση και η παραγωγή από το προσβεβλημένο κύτταρο των ιντερφερονών τυπου Ι. Προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριο μας, έχουν επακριβώς περιγράψει πως αυτή η μεταγραφική ενεργοποίηση επιτυγχάνεται στην περίπτωση του γονιδίου της IFN-β. Σημαντικές πτυχές αυτής της διαδικασίας αποτελούν η στοχαστικότητα της γονιδιακής έκφρασης μέσω των διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων και η μονοαλληλική έκφραση. Βασικός σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να περιγράψει τον μηχανισμό με τον οποίο ενορχηστρώνεται η διαδικασία της αντιϊικής απόκρισης, με σκελετό τον τρισδιάστατο χώρο του πυρήνα. Είναι γνωστό από προηγούμενες εργασίες ότι μετά την ιική μόλυνση, ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB ενεργοποιείται και εισέρχεται στην περιοχή του πυρήνα. Ο συγκεκριμένος μεταγραφικός παράγοντας παρουσιάζει ~106 θέσεις πρόσδεσης στο ανθρώπινο γονιδίωμα, άλλες υψηλής και άλλες χαμηλής συγγένειας. Ο αριθμός των γονιδίων που είναι γνωστό ότι ρυθμίζει, είναι περίπου 500. Το ερώτημα που άμεσα προκύπτει είναι το πως αυτός ο μεταγραφικός παράγοντας καταφέρνει να εντοπίσει τις θέσεις πρόσδεσης, των γονιδίων εκείνων τα οποία πρέπει να ρυθμιστούν ανάλογα με το ερέθισμα. Στην παρούσα διατριβή, ασχολούμαστε αρχικά με μια ιδιαίτερη ομάδα DNA στοιχείων που περιέχουν θέσεις πρόσδεσης για τον NF-κB, η οποία όμως γειτνιάζει με επαναλαμβανόμενα Alu στοιχεία. Οι θέσεις αυτές αποκλίνουν σε ένα βαθμό από τις τυπικές (consensus) αλληλουχίες πρόσδεσης του NF-κB και συνήθως βρίσκονται μακριά από στοιχεία υποκινητή/ενισχυτή. Μελέτες που έγιναν στο εργαστήριο μας, έδειξαν ότι οι περισσότερες θέσεις πρόσδεσης (όχι απλώς πιθανές, αλλά εκείνες που ταυτοποιούνται ως λειτουργικές) δεν μπορούν να συσχετιστούν με μεταγραφική ενεργοποίηση. Είναι εμφανές ότι πρέπει να ερευνήσουμε τον ρόλο που παίζει αυτός ο μεγάλος αριθμός θέσεων πρόσδεσης στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Στην προσπάθειά μας αυτή, βρέθηκε μια νέα θέση πρόσδεσης του μεταγραφικού αυτού παράγοντα που περιέχει στοιχεία Alu και υπάρχει σε πολλά αντίγραφα. Τα στοιχεία που αποτελούν αυτή την ομάδα δεν παρουσιάζουν σε καμία περίπτωση κοινά λειτουργικά χαρακτηριστικά, σε σχέση με την μεταγραφική ενεργοποίηση. Οι μελέτες του εργαστηρίου έδειχναν ότι κάποια από αυτά τα στοιχεία, λειτουργούσαν ως διανομείς των μεταγραφικών παραγόντων σε θέσεις ρύθμισης στο γονιδίωμα. Πρώτο μέλημα της παρούσας εργασίας είναι να ταυτοποιήσει τους στόχους του NF-κB στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Με την χρήση σύγχρονων τεχνολογιών, καταφέραμε να χαρτογραφήσουμε τον τρόπο με τον οποίο κατανέμονται τα γεγονότα πρόσδεσης μετά την μόλυνση με ιό Sendai και παρατηρήσαμε μια ευρεία διασπορά αυτών σε διαφορετικού χαρακτήρα στοιχεία. Η ανάλυση των συγκεκριμένων γεγονότων και οι αλληλουχίες των θέσεων πρόσδεσης που προκύπτουν, ανέδειξαν ένα νέο στοιχείο πρόσδεσης, τα χαρακτηρηστικά του οποίο περιγράψαμε παραπάνω. Το στοιχείο αυτό ονομάστηκε Alu-κB και η λειτουργία ήταν πριν την συγκεκριμένη εργασία σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Τα μέλη αυτής της ομάδας βρέθηκε πως έχουν διαφορετικές ιδιότητες, διαφορετική κατανομή στο γονιδίωμα, διαφορετικές προτιμήσεις ως προς το χρωματινικό περιβάλλον και διαφορετική συμβολή στη μεταγραφική ενεργότητα. Μελετήθηκε η κατανομή των συγκεκριμένων θέσεων πρόσδεσης στο γονιδίωμα και συγκεκριμένα σε κάθε χρωμόσωμα, καθώς και η εξειδίκευση που αυτές οι θέσεις φαίνεται να παρουσιάζουν στον άνθρωπο, κάτι που ανέδειξε ανάλυση αυτών των θέσεων στο ποντίκι. Οι θέσεις αυτές πρόσδεσης φέρουν τον NF-κB στις περισσότερες των περιπτώσεων μετά την ιϊκή μόλυνση, σε κάποιες όμως ακόμη και πριν. Επίσης κάποιες δείχνουν να έχουν την ικανότητα να στρατολογήσουν την αρχιτεκτονική πρωτεΐνη HMG(I)Y ή να απαντούν με πρόσδεση του NF-κB και σε άλλα ερεθίσματα εκτός του ιού, όπως ο TNF-α. Επιπροσθέτως, κάποιες από αυτές μπορούν να προσδέσουν τον NF-κB ή και άλλες υπομονάδες της ίδιας οικογένειας σε άλλες κυτταροσειρές, ενεργοποιημένες μέ αλλο τύπο ιού (EBV). Έγινε εκτενής ανάλυση της συγγένειας με τον μεταγραφικό παράγοντα in vitro και αποδείχθηκε ότι οι θέσεις που ανήκουν στην Alu-κB οικογένεια, παρουσιάζουν ποικιλία και στην συγγένεια. Μελετήθηκε η μεταγραφική ενεργότητα ενδεικτικά κάποιων από αυτά τα στοιχεία in vitro με συστήματα μεταγραφής καθώς και η δυνατότητα μεταγραφικής ενεργοποίησης που έχουν αυτά τα στοιχεία, με χρήση τους σε τεχνητούς υποκινητές και μέτρηση κατόπιν της μεταγραφικής ενεργότητας. Και στις δύο παραπάνω περιπτώσεις, οι ιδιότητες ποικίλουν καθώς υπήρξαν στοιχεία που παρουσιάζουν ισχυρή ικανότητα προς μεταγραφική ενεργοποίηση και στοιχεία που δεν παρουσιάζουν καθόλου τέτοια χαρακτηριστικά. Τέλος, με την χρήση της τεχνολογίας DNA FISH δείχθηκε ότι κάποια μέλη αυτής της οικογένειας λαμβάνουν μέρος σε διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις με αποτέλεσμα την ενίσχυση της μεταγραφικής ενεργοποίησης συγκεκριμένων γονιδίων, ενώ άλλα στοιχεία που παρουσιάζουν υψηλή ομοιότητα με τα προηγούμενα δεν διαθέτουν κανένα από τα δύο χαρακτηρηστικά. Με βάση τα παραπάνω ευρήματα, θελήσαμε να εστιάσουμε στις ιδιότητες που έχουν εκείνα τα στοιχεία της Alu-κB οικογένειας που έχουν την ικανότητα να συμμετέχουν σε διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις και να ενισχύουν με αυτό τον τρόπο την μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων. Από προηγούμενη μελέτη, γνωρίζουμε ότι τα συγκεριμένα DNA στοιχεία συγκροτούν δυναμικές δομές που ονομάζονται NRCs (NF-κB Receptor Centers). Επόμενο βήμα στην μελέτη είναι να απομονώσουμε και να μελετήσουμε σε βάθος τα βασικά γονίδια που λαμβάνουν μέρος στην αντιϊική απόκριση. Το ζητούμενο είναι να μελετήσουμε γονίδια τα οποία ρυθμίζονται από τον NF-κB μέσω των NRCs. Με την βοήθεια της τεχνολογίας των DNA microarrays, καταφέραμε να ταυτοποιήσουμε τέτοια γονίδια, μερικά από αυτά με βάση την γονιδιακή οντολογία τους αποτελούν πολύ σημαντικά κομμάτια της άμυνας του κυττάρου. Επιλέξαμε να μελετήσουμε εις βάθος γονίδια τα οποία δεν επάγονται ως δευτερογενές φαινόμενο από την παραγωγή της IFN-β, αντίθετα επάγονται από ιό, ρυθμίζονται από τον NF-κB και από στοιχεία των NRCs. Με βάση την παραπάνω υπόθεση εργασίας, αποδεικνύουμε στην παρούσα μελέτη ότι οι γενωμικές περιοχές αυτών των γονιδίων έρχοναι σε επαφή μέσω διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων με τα NRCs, μετά από ιϊκή μόλυνση. Σε επόμενο βήμα αποδεικνύουμαι ότι η έκφραση αυτών των γονιδίων δεν παρατηρείται στο σύνολο των κυττάρων του πληθυσμού που προσβλήθηκε από τον ιό, αλλά μόνο σε κάποια. Η έκφραση λοιπόν αυτών των γονιδίων χαρακτηρίζεται στοχαστική και συγκεκριμένα παρατηρήσαμε στα πειράματά μας, ότι εκφράζεται μόνο το ένα αλλήλιο του γονιδίου. Το σημαντικότερο εύρημα αυτού του τμήματος της μελέτης είναι ότι το αλλήλιο που παράγει μετάγραφα για κάθε γονίδιο που μελετούμε, ταυτίζεται με το αλλήλιο του γονιδίου που αλληλεπιδρά με τα NRCs. Δηλαδή, αν μελετήσουμε το κάθε γονίδιο μεμονωμένα αλλά σε σχέση με τα NRCs, παρατηρούμε την δημιουργία μεταγράφεων από ένα αλλήλιο που συμμετέχει σε μία αλληλεπίδραση. Ερώτημα κλειδί της παρούσας διατριβής είναι το πως συμπεριφέρεται το κάθε κύτταρο στα πλαίσια του πληθυσμού. Μέχρι στιγμής οι μελέτες μας περιορίστηκαν στις αλληλεπιδράσεις που συμβαίνουν στο τρισδιάστατο χώρο του πυρήνα κάθε κυττάρου. Μελέτες στην έκφραση κάθε γονιδίου σε επίπεδο πληθυσμού, μας έδειξαν πως υπήρχαν διαφορές στα επίπεδα και στο χρονικό πρότυπο από γονίδιο σε γονίδιο. Αναρωτηθήκαμε αν τα κύτταρα συμμετέχουν στην αντιϊκή απόκριση εκφράζοντας μόνο κάποια από τα γονίδια που απαιτούνται ή εάν αποφασίζουν να εκφράσουν τελικά την πλήρη ομάδα των γονιδίων της άμυνας έναντι ιών. Παρατηρούμε αλληλοεπικαλυπτόμενους πληθυσμούς κυττάρων που εκφράζουν διαφορετικά γονίδια ή ένα κλάσμα του πληθυσμού που εκφράζει όλα τα απαραίτητα γονίδια? Δώσαμε απάντηση σε αυτό το ερώτημα με τα πειράματα επί τόπου υβριδοποίησης αλλά και με μελέτες γονιδιακής έκφρασης στο επίπεδο του ενός κυττάρου και διαπιστώσαμε ότι ισχύει η δεύτερη περίπτωση. Επιβεβαιώσαμε διαφορές στο χρονικό πρότυπο έκφρασης των γονιδίων. Διατυπώνουμε την υπόθεση ότι υπάρχουν δύο ομάδες γονιδίων σύμφωνα με το χρονικό πρότυπο έκφρασής τους, τα πρώιμα και τα μεταγενέστερα. Το κύτταρο εκφράζοντας κάποιο ή κάποια από τα πρώιμα γονίδια αυξάνει τις πιθανότητες να εκφράσει την πλήρη ομάδα των γονιδίων σε μεταγενέστερο στάδιο, μοιάζει δε να παίρνει μια απόφαση για την «μοίρα» του ως ένα από τα κύτταρα που θα συμμετέχουν στην αντιϊική απόκριση. Προκειμένου να μελετήσουμε επακριβώς τι συμβαίνει στον πυρήνα του κυττάρου και τις δομές κλειδιά της διαδικασίας μετά την μόλυνση από ιό, στις διαστάσεις του χώρου και του χρόνου, αναλύσαμε το σύστημα σφαιρικά. Αρχικά, σημάναμε όλες τις περιοχές ταυτόχρονα αλλά με διαφορετικό τρόπο ρυθμιζόμενους και ρυθμιστές. Παρατηρήσαμε ότι οι δομές των NRCs προϋπάρχουν της ιϊκής μόλυνσης αλλά συγκροτούνται σε μεγαλύτερο βαθμό μετά από αυτήν. Οι περιοχές των γονιδίων που επρόκειτο να εκφραστούν σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία, δημιουργούσαν αλληλεπιδράσεις με τα NRCs. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να παρατηρούμε σε κάθε κύτταρα πολλαπλές αλληλεπιδράσεις μεταξύ γονιδίων και NRCs και να δημιουργούνται νέα ερωτήματα ως προς την λειτουργική εξειδίκευση των NRCs. Σε επόμενο βήμα σημάναμε με διαφορετικό τρόπο τα τρία στοιχεία που γνωρίζουμε ότι συγκροτούν τα NRCs και αναλύσαμε τις ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά συγκρότησης αυτών των δομών από την στιγμή πριν την μόλυνση μέχρι και 4 ώρες μετά, όπου οι περισσότερες διαχρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις έχουν λάβει χώρα. Η παραπάνω ανάλυση υπήρξε ιδιαιτέρως διαφωτιστική. Στο τελευταίο τμήμα της μελέτης, δώσαμε δύο νέες προοπτικές στην κατεύθυνση της έρευνας μας. Στην πρώτη, γνωρίζοντας ότι η διαδικασία της αντιϊικής απόκρισης είναι πολύ πιο πολύπλοκη από ότι δείχνουν οι μέχρι στιγμής μελέτες μας, χρησιμοποιήσαμε τεχνολογίες αιχμής (4C chip), προκειμένου να χαρτογραφήσουμε στην ολότητά τους πιθανές αλληλεπιδράσεις των NRCs, με νέες περιοχές, ρυθμιστικές ή ρυθμιζόμενες στον πυρήνα του κυττάρου, πριν και μετά την μόλυνση με ιό. Τα πειράματα αυτά είχαν ως αποτέλεσμα τεράστιο όγκο πληροφορίας, την οποία εκμεταλλευόμαστε προκειμένου να αναπαραστήσουμε σαφέστερα τις κινήσεις των περιοχών στον πυρήνα. Τέλος, δώσαμε ιδιαίτερη σημασία στον μηχανισμό που αποτελεί την κινητήριο δύναμη των διαχρωμοσωμικών αλληλεπιδράσεων, προτείνοντας μόρια και χημικές διαδικασίες που παίρνουν μέρος και τελικά προτείνοντας ένα ολοκληρωμένο μοντέλο για το τι συμβαίνει στο πυρήνα ενός κυττάρου που έχει μολυνθεί από ιό.