Μοριακή ανίχνευση, ταξινόμηση και συγκριτική γονιδιωματική των εντεροϊών βασισμένη στην VP1 περιοχή του γονιδιώματός τους

Abstract

VP1 is known to be a very important region of the Enteroviral genome, since it possesses specific properties which constitute the base for the identification and study of newly characterized Enterovirus strains. In an attempt to validate modem molecular techniques, applied in identification and typing of unknown Enteroviruses, this specific genomic portion was selected for the comparison of different RT-PCR protocols. Based on the results of the aforementioned comparison, the 5' end of the VP1 coding region was chosen to be more appropriate for the identification of new Enteroviruses, whilst its 3' end presented the best typing results. Subsequently, two different genomic portions of VP 1 and the full length of 2A coding region were analyzed, showing that the serotype-genotype congruence, which is the base for the identification of new strains by the use of molecular approaches, presents an explicit genomic delimitation, which was clearly defined in the present study. In addition, through sequencing analysis of linear (2A, 2B and 2C) and more distant genomic regions of the strains (3D), we succeeded in performing a comparative study of the strains in terms of nucleotide distances and phylogeny. The aforementioned study revealed that the evolution of Coxsackie viruses presents a different profile in structural and functional parts of their genome, with the alternation of divergent and convergent events being its main distinctive mark. In fact, the conversion of the strains’ genomes, which is for the first time presented in this work, seems to acquire inter-specific dimension when the 3' end of the enteroviral genome is being analyzed. This result comes to congruence with all the theories that have been developed to describe Enteroviruses’ evolution and alerts for the possible appearance of altered viruses with unpredictable clinical manifestations and virulence.

H VP1 γενετική περιοχή των Εντεροϊών αποτελεί ένα ιδιαίτερα σημαντικό τμήμα του γονιδιώματός τους, μιας και λόγω ορισμένων χαρακτηριστικών ιδιοτήτων που διαθέτει, αποτελεί τη βάση για την ταυτοποίηση και μελέτη νέων στελεχών εντεροϊών στα πλαίσια της σύγχρονης μοριακής διαγνωστικής. Η συγκεκριμένη περιοχή επιλέχθηκε ως βάση για την σύγκριση διαφορετικών πρωτοκόλλων ανίχνευσης και ταυτοποίησης κλινικών στελεχών Coxsackie ιών, σε μία αρχική προσπάθεια αξιολόγησης των σύγχρονων μοριακών τεχνικών ανίχνευσης. Τα αποτελέσματα της σύγκρισης έκριναν το 5' άκρο του γονιδιώματος, που κωδικοποιεί για την VP1 πρωτεΐνη ως καταλληλότερο από άποψη ευαισθησίας και ειδικότητας για την ανίχνευση των εντεροϊών, ενώ το 3' άκρο παρουσίασε την μεγαλύτερη καταλληλότητα για την ταυτοποίηση των κυκλοφορούντων στελεχών εντεροϊών. Ακολούθως, με βάση δύο διαφορετικά τμήματα της VP1 και μία γειτονική γενετική περιοχή, η οποία κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη 2Α, πραγματοποιήθηκε συγκριτική φυλογενετική ανάλυση των προαναφερθέντων κλινικών στελεχών, η οποία έδειξε ότι η ταύτιση του οροτύπου με τον γονότυπο των στελεχών και συνεπώς η δυνατότητα ταυτοποίησης νέων στελεχών με μοριακές μεθόδους παρουσιάζει σαφή γονιδιακή οριοθέτηση, η οποία προσδιορίστηκε στην παρούσα εργασία. Ταυτόχρονα, μέσω ανάλυσης της πρωτοδιάταξης ορισμένων γειτονικών (2Α, 2Β και 2C) αλλά και απομακρυσμένων περιοχών του γονιδιώματος των εντεροϊών (3D), επιτεύχθηκε μία συγκριτική νουκλεοτιδική και φυλογενετική μελέτη των κλινικών στελεχών. Η συγκεκριμένη ανάλυση έδειξε ότι η εξέλιξη των Coxsackie ιών παρουσιάζει διαφορετική εικόνα στις δομικές και λειτουργικές περιοχές του γονιδιώματός τους με κύριο γνώρισμα την εναλλαγή γεγονότων αποκλίνουσας και συγκλίνουσας εξέλιξης. Μάλιστα, η σύγκλιση του γονιδιώματος των κλινικών στελεχών εντεροϊών, η οποία παρουσιάζεται στη συγκεκριμένη εργασία για πρώτη φορά, φαίνεται να αποκτά δια-ειδικές διαστάσεις προς το 3' άκρο του γονιδιώματός τους, γεγονός, το οποίο έρχεται σε αντίθεση με τις μέχρι τώρα γνωστές θεωρίες σχετικά με την εξέλιξη των εντεροϊών και εφιστά την προσοχή για την πιθανή εμφάνιση διαφοροποιημένων στελεχών με μη προβλέψιμες μολυσματικές και παθογόνες ιδιότητες.