Study of isolation and utilization techniques of bioactive compounds derived from marine organisms and their by-products with the aim of developing innovative fish feeds

Abstract

The research carried out in the context of this PhD thesis advocates a new approach in the aquaculture industry regarding the improvement of cultivation and quality of farmed fish species through the use of added value bioactive substances of marine origin. Through the investigation and development of appropriate technical methods of extraction as well as formulation of the ingredients for their maximum effectiveness, the goal is to create innovative food supplements using sustainable marine resources such as microalgae, macroalgae and fish by-products. Subsequently, the beneficial substances of the produced bioactive extracts are studied in terms of enriching the nutritional value of farmed fish, enhancing their growth and/or strengthening their immune system, with the ultimate goal of reducing dependence on additional antibiotic agents and/or reducing nutritional costs in the aquaculture industry. The research objectives of the PhD thesis are the evaluation and characterization of bioactive compounds derived from marine organisms and their by-products, as a sustainable source of fish feed additives, their recovery optimization through the use of green extraction techniques and the investigation of the antibacterial activity of selected extracts with the subsequent evaluation of their effect on important fish species of Greek and European aquaculture on a semi-pilot scale. The appropriate techniques for the biochemical characterization of fish and micro-/macro-algae biomass, as well as the extraction, analysis and encapsulation of their bioactive compounds were investigated in order to reach the first two objectives while the investigation of the antibacterial activity of a final bioactive extract and its laboratory scale feeding trials took place in order to evaluate the use of bioactive extracts as fish feed supplements within the scope of the third objective. Innovative isolation and utilization techniques of bioactive compounds such as collagen, fatty acids, carotenoids, phenolics and polysaccharides were used in this research, regarding the synthesis and investigation of deep eutectic solvents (DESs), the condition optimization of encapsulation of bioactive compounds through electrospinning, as well as their analysis using Scanning Electron Microscopy (SEM), Fourier Transform Infrared Spectrometry (FTIR) and liquid/gas chromatography (HPLC, GC). The results of the present study provided technical and scientific knowledge towards the establishment of invasive fish species as a sustainable alternative source of bioactive compounds through the successful extraction and encapsulation, using the electrospinning method, of marine collagen and fatty acids from the species Lagocephalus sceleratus, Fistularia commersonii and Pterois miles. Regarding the exploitation of marine algae, the appropriate analysis methodology was established for the characterization of the extracted bioactive compounds. A variety of DES-based solvent systems were successfully synthesized and evaluated for their efficiency to extract bioactive compounds from macroalgae, Ulva lactuca, and microalgae, Chlorella vulgaris, while the conventional and microwave assisted extraction techniques were optimized regarding the extraction conditions using U. lactuca biomass. Through this process, a final algae extract of high antioxidant activity was produced in order to be used as fish feed additive on the diet of Dicentrarchus labrax juveniles for two months. Positive results were found on the growth performance and biochemical characteristics of the fish while the in vitro study of the antibacterial activity of the extract showed inhibition of growth for important aquaculture bacterial strains such as Vibrio anguillarum O1, Photobacterium damselae sub. piscicida and Tenacibaculum maritimum.

Η έρευνα που εκτελείται στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής πρεσβεύει μια νέα προσέγγιση στην βιομηχανία της υδατοκαλλιέργειας η οποία αφορά τη βελτίωση της εκτροφής και ποιότητας των καλλιεργούμενων ειδών ιχθύων μέσω της χρήσης βιοδραστικών ουσιών προστιθέμενης αξίας προερχόμενων από το θαλάσσιο περιβάλλον. Μέσω της διερεύνησης και ανάπτυξης κατάλληλων τεχνικών μεθόδων εκχύλισης αλλά και διαμόρφωσης του προϊόντος για την μέγιστη αποτελεσματικότητά του, στόχος είναι η δημιουργία καινοτόμων συμπληρωμάτων διατροφής με τη χρήση βιώσιμων θαλάσσιων πόρων όπως είναι τα μικροφύκη, μακροφύκη αλλά και προϊόντα ιχθύων. Εν συνεχεία, οι ευεργετικές ιδιότητες των παραγόμενων βιοδραστικών εκχυλισμάτων μελετώνται ως προς τον εμπλουτισμό της διατροφικής αξίας των καλλιεργούμενων ιχθύων, την ενίσχυση της ανάπτυξής τους ή/και την ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματός τους, με απώτερο στόχο την μείωση εξάρτησης από πρόσθετους αντιβιοτικούς παράγοντες ή/και την μείωση του διατροφικού κόστους στην βιομηχανία της υδατοκαλλιέργειας. Οι ερευνητικοί στόχοι της διδακτορικής διατριβής είναι η αξιολόγηση και ο χαρακτηρισμός βιοδραστικών ενώσεων που προέρχονται από θαλάσσιους οργανισμούς και παραπροϊόντα τους, ως βιώσιμη πηγή πρόσθετων σκευασμάτων στις ιχθυοτροφές, η βελτιστοποίηση της ανάκτησής τους μέσω της χρήσης τεχνικών πράσινης εκχύλισης και η διερεύνηση της αντιβακτηριδιακής δράσης των επιλεγμένων εκχυλισμάτων με την μεταγενέστερη αξιολόγηση της επίδρασής τους σε σημαντικά είδη της ελληνικής και ευρωπαϊκής ιχθυοκαλλιέργειας σε ημι-πιλοτική κλίμακα. Οι κατάλληλες τεχνικές για τον βιοχημικό χαρακτηρισμό της βιομάζας ιχθύων και μίκρο-/μάκρο-φυκών, καθώς και την εκχύλιση, την ανάλυση και τον εγκλεισμό των περιεχόμενων βιοδραστικών συστατικών διερευνήθηκαν για την επίτευξη των δύο πρώτων στόχων ενώ στη συνέχεια έγινε αξιολόγηση της διατροφικής χρήσης βιοδραστικού εκχυλίσματος μέσω της διερεύνησης της αντιβακτηριδιακής του δράσης έναντι σημαντικών βακτηριακών στελεχών καθώς και ενσωμάτωσή του σε διατροφικά πειράματα ιχθύων στις εγκαταστάσεις του υγρού εργαστηρίου Υδατοκαλιεργειών στα πλαίσια του τρίτου στόχου. Στην παρούσα έρευνα χρησιμοποιήθηκαν καινοτόμες τεχνικές απομόνωσης και αξιοποίησης βιοδραστικών ενώσεων όπως κολλαγόνο, λιπαρά οξέα, καροτενοειδή, φαινολικά και πολυσακχαρίτες και αφορούν μεταξύ άλλων την παρασκευή και διερεύνηση της χρήσης βαθέως ευτηκτικών διαλυτών, τη διερεύνηση εγκλεισμού των βιοδραστικών ενώσεων μέσω της ηλεκτροστατικής ινοποίησης καθώς και την ανάλυση αυτών με υπέρυθρη φασματοσκοπία (FTIR), ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM), και υγρή/αέρια χρωματογραφία (HPLC, GC). Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης παρέχουν σημαντική τεχνική και επιστημονική γνώση στα πλαίσια της καθιέρωσης χωροκατακτητικών ειδών ιχθύων ως βιώσιμη εναλλακτική πηγή βιοδραστικών ενώσεων μέσω της επιτυχούς εκχύλισης και ενθυλάκωσης του κολλαγόνου και λιπαρών οξέων από τα είδη Lagocephalus sceleratus, Fistularia commersonii και Pterois miles. Όσον αφορά την αξιοποίηση θαλάσσιων φυκών, έγινε καταγραφή των κατάλληλων μεθόδων ανάλυσης για τον χαρακτηρισμό των εκχυλισμένων βιοδραστικών ενώσεων. Εν συνεχεία, έγινε επιτυχής σύνθεση ενός μεγάλου εύρους βαθέως ευτηκτικών διαλυτών οι οποίοι αξιολογήθηκαν ως προς την αποτελεσματικότητά τους στην εκχύλιση βιοδραστικών ενώσεων από μακροφύκη, Ulva lactuca και μικροφύκη, Chlorella vulgaris, ενώ στη συνέχεια έγινε η βελτιστοποίηση των συνθηκών εκχύλισης μακροφυκών για την κλασσική και υποβοηθούμενη με μικροκύματα εκχύλιση. Μέσω αυτής της διαδικασίας, παρήχθη ένα τελικό εκχύλισμα φυκών υψηλής αντιοξειδωτικής δράσης το οποίο χορηγήθηκε ως πρόσθετο ιχθυοτροφής νεαρών ατόμων Dicentrarchus labrax για δύο μήνες. Τα αποτελέσματα ήταν θετικά για την ανάπτυξη και τα βιοχημικά χαρακτηριστικά των ιχθύων ενώ η in vitro μελέτη της αντιβακτηριακής δράσης του εκχυλίσματος έδειξε αναστολή της ανάπτυξης σε σημαντικά βακτηριακά στελέχη της υδατοκαλλιέργειας όπως Vibrio anguillarum O1, Photobacterium damselae sub. piscicida και Tenacibaculum maritimum.