Διερεύνηση κρίσιμων βιοδεικτών που σχετίζονται με την εντερική ακεραιότητα και λειτουργία με πρότυπο τα πτηνά

Abstract

The aim of the present thesis was to evaluate in depth the molecular mechanisms of action along the intestine of broiler chickens with the effects of targeted nutritional factors. The elucidation of the mechanisms of action was carried out by studying a series of selected intestinal molecular biomarkers, involved in important molecular pathways for intestinal integrity, function and health, while also monitoring their growth performances. For this purpose, two different in vivo experiments were conducted. The first one was based on dietary changes using a diet with different levels of metabolizable energy (ME) and crude protein (CP) with or without the addition of a phytogenic feed additive (PFA) and in the other an indigestible - dysbiotic diet was used with or without the addition of mycotoxins, specifically the addition of deoxynivalenol (DON) and fumonisins (FUM). Analytical determination of growth performances such as body weight gain (BWG), feed intake (FI) and feed conversion ratio (FCR) was carried out and the study of the molecular pathways related to the intestinal barrier, detoxification, antioxidant activity, immune response, cell apoptosis as well as protein synthesis through relative gene expression. The above measured and analyzed in the context of three individual studies which are also separate chapters of this thesis. To be more specific, the first and the second studies was based in two types of diet designed to meet 95% and 100% of the optimal metabolizable energy (ME) and crude protein (CP) specifications of the Cobb 500, and are denoted as L and H, respectively. Addition or absence of PFA1 was performed at a concentration of 150 mg/kg per diet and 540 day-old male Cobb 500 broiler chickens were used. The experiment lasted 42 days. The statistical analysis of the results obtained in the 2 above studies was performed by the general linear model, with factors being the type of diet (L and H) and the addition of PFA1 (- and +). It was generally found that the growth performances of the broilers were improved in the H- and H+ treatments compared to the L− and L+, and at the same time the L+ treatment had a better BWG and FCR compared to the L− treatment. Also, the broilers fed with the H diet showed higher BWG (PD < 0.001), FI (PD = 0.046) and lower FCR (PD < 0.001) compared to the L treatment. In addition, the addition of PFA1 significantly increased BWG (PP = 0.002) and improved FCR (PP = 0.043). Regarding the relative gene expression (RGE) with the reduction of ME and CP, most of the results was observed in ileum and caecum. Specifically, there was an activation of the immune response with a significantly increase (PD<0.05) of genes related to the TLR pathway. At the same time, there were indications on the activation of pathways related to apoptosis and protein synthesis with the increase (PD<0.05) of 2 genes from those studied. Finally, an increased gene antioxidant activity was observed on L treatment compared to H in caecum. The addition of PFA1 affected gene expression mainly in the duodenum. Specifically, a significant reduction (PP<0.05) of genes related to the TLR pathway was found and at the same time an enhanced antioxidant activity was noted with the increase of 7 genes out of 13 with the addition of PFA1. The results for the antioxidant activity were confirmed by the increase of the total antioxidant capacity upon the addition of PFA1 (PP<0.05).The third study examined the addition of 2 different mycotoxins, deoxynivalenol (DON) and fumonisins (FUM) in a less digestible - dysbiosis diet (DS). The DS diet was established as a model that promoted intestinal dysbiosis in broilers. A total of 378 male broiler chickens (Ross 308) were randomly assigned to 3 experimental treatments for 39 days which were DS (without other additions used as a control), DS with added DON (5 mg/kg diet) and DS with added FUM (20 mg/kg diet). The statistical analysis of the results obtained in the above study was performed by ANOVA analysis. BWG and FI were found to be significantly different between interventions. Specifically, the chickens of the DON and FUM treatments had a lower (P = 0.002) BWG compared to the DS. In addition, FUM treatment significantly reduced FI (P = 0.018) compared with DS. Upon the addition of DON, the detoxification pathway was activated in the duodenum, jejunum and ileum, while antioxidant activity was shown to be negatively affected in the ileum and caecum. Additionally, FUM treatment was shown to primarily affect gene expression in the duodenum and cecum. In the duodenum specifically, the genes related to the immune response (TLR4, NFkB1) increased, while in the cecum the antioxidant activity was negatively affected by the addition of FUM. In conclusion, the expression of critical biomarkers related to intestinal integrity and function was found to be significantly influenced by the type of diet and specifically by its content in metabolizable energy and crude protein, as well as the general composition of the diet with participation of less digestible feedstuffs. Additionally, the supplementation of plant bioactive components as well as the presence of mycotoxins in the feed had a significant effect on the studied biomarkers. In the context of this thesis, new knowledge has been created regarding the intensity of the genes’ expression related to the intestinal barrier and the molecular mechanisms of detoxification, antioxidant defense, immune response, cell apoptosis and protein synthesis. Importantly, the above effects were mapped along the gut of broiler chickens revealing not only the mode but also the site of action of the factors studied.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή (ΔΔ) διερευνήθηκαν σε βάθος οι μοριακοί μηχανισμοί δράσης σε όλο το μήκος του εντερικού σωλήνα ορνιθίων κρεοπαραγωγής που σχετίζονται με την επίδραση στοχευμένων διατροφικών παραγόντων. Η αποσαφήνιση των μηχανισμών δράσης πραγματοποιήθηκε μελετώντας μια σειρά επιλεγμένων εντερικών μοριακών βιοδεικτών, εμπλεκόμενων σε σημαντικά μοριακά μονοπάτια για την εντερική ακεραιότητα, λειτουργία και υγεία, παρακολουθώντας παράλληλα και τις παραγωγικές τους αποδόσεις. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά in vivo πειράματα. Στο πρώτο χρησιμοποιήθηκε σιτηρέσιο με διαφορετικά επίπεδα μεταβολιστέας ενέργειας (ΜΕ) και ολικής πρωτεΐνης (ΟΠ) με ή χωρίς την προσθήκη ενός φυτικού βιοενεργού συστατικού (ΦΒΣ) και στο άλλο χρησιμοποιήθηκε ένα δύσπεπτο σιτηρέσιο με ή χωρίς την προσθήκη μυκοτοξινών και συγκεκριμένα προσθήκη δεοξινυβαλενόλης (DON) και φουμονισινών (FUM). Προσδιορίστηκε ο ρυθμός αύξησης του σωματικού βάρους (ΡΑΣΒ), η κατανάλωση της τροφής (ΚΤ) και ο συντελεστής εκμετάλλευσης της τροφής (ΣΕΤ), και υλοποιήθηκε η μελέτη των μοριακών μονοπατιών που αφορούν τον εντερικό φραγμό, την αποτοξίνωση, την αντιοξειδωτική δράση, την ανοσιακή απόκριση, την κυτταρική απόπτωση καθώς και την πρωτεΐνοσύνθεση μέσω της σχετικής γονιδιακής έκφρασης. Τα παραπάνω αναλύθηκαν στο πλαίσιο τριών επιμέρους μελετών που αποτελούν και ξεχωριστά κεφάλαια της παρούσας ΔΔ.Στην πρώτη και στη δεύτερη μελέτη εξετάσθηκαν δύο τύποι σιτηρεσίου με βάση το % ποσοστό κάλυψης των συνιστομένων προδιαγραφών σε μεταβολιστέα ενέργεια (ΜΕ) και ολική πρωτεΐνη (ΟΠ) από τον παραγωγό του υβριδίου Cobb 500. Συγκεκριμένα, οι δύο τύποι σιτηρεσίων σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να καλύπτουν το 95% και το 100% των βέλτιστων προδιαγραφών ΜΕ και ΟΠ, με σήμανση L και H, αντίστοιχα. Επίσης κάθε τύπος σιτηρεσίου εξετάσθηκε με ή χωρίς την προσθήκη ΦΒΣ1 σε συγκέντρωση 150 mg/kg σιτηρεσίου. Για το σκοπό του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν 540 αρσενικά ορνίθια κρεοπαραγωγής Cobb 500 μιας ημέρας και το πείραμα ήταν διάρκειας 42 ημερών. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν στις 2 παραπάνω μελέτες έγινε με το γενικό γραμμικό μοντέλο, με παράγοντες τον τύπο του σιτηρεσίου (L και H) και την προσθήκη του ΦΒΣ1 (- και +). Βρέθηκε γενικά ότι τα παραγωγικά χαρακτηριστικά των ορνιθίων βελτιώθηκαν στις επεμβάσεις H- και H+ σε σύγκριση με τις L− και L+, και παράλληλα τα ορνίθια της επέμβασης L+ είχαν καλύτερο ΡΑΣΒ και ΣΕΤ σε σύγκριση με την επέμβαση L−. Ακόμα, τα ορνίθια που τρέφονταν με σιτηρέσιο τύπου Η παρουσίασαν υψηλότερο ΡΑΣΒ (PΔ < 0.001), ΚΤ (PΔ = 0.046) και χαμηλότερο ΣΕΤ (PΔ < 0.001) σε σύγκριση με την L επέμβαση. Επιπλέον, η προσθήκη ΦΒΣ1 αύξησε σημαντικά το ΡΑΣΒ (PΦ = 0.002) και βελτίωσε τον ΣΕΤ (PΦ = 0.043). Όσον αφορά τη σχετική γονιδιακή έκφραση (ΣΓΕ) με τη μείωση των ΜΕ και ΟΠ παρατηρήθηκε συγκέντρωση των αποτελεσμάτων στον ειλεό και στα τυφλά. Πιο συγκεκριμένα, σημειώθηκε ενεργοποίηση της ανοσιακής απόκρισης με τη στατιστικώς σημαντική αύξηση (PΔ<0.05) των γονιδίων που αφορούν το TLR μονοπάτι. Παράλληλα, υπήρξαν ενδείξεις για την ενεργοποίηση των μονοπατιών που αφορούν την απόπτωση και την πρωτεϊνοσύνθεση με την αύξηση (PΔ<0.05) δύο γονιδίων από αυτά που μελετήθηκαν. Τέλος, στα τυφλά παρατηρήθηκε αυξημένη γονιδιακή αντιοξειδωτική δράση στην L επέμβαση σε σχέση με την επέμβαση H. Η προσθήκη του ΦΒΣ1 επηρέασε τη γονιδιακή έκφραση κυρίως στο δωδεκαδάκτυλο. Αναλυτικότερα, διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική μείωση (PΦ<0.05) των γονιδίων που αφορούν το TLR μονοπάτι και παράλληλα σημειώθηκε ενισχυμένη αντιοξειδωτική δράση με την αύξηση 7 γονιδίων από τα 13 με την προσθήκη του ΦΒΣ1. Τα αποτελέσματα για την αντιοξειδωτική δράση επιβεβαιώθηκαν με την αύξηση της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας κατά την προσθήκη του ΦΒΣ1 (PΦ<0.05). Η μελέτη των μηχανισμών δράσης με την παρουσία ξενοβιοτικών εξετάσθηκε στη 3η μελέτη με την προσθήκη 2 διαφορετικών μυκοτοξινών, της δεοξινυβαλενόλης (DON) και των φουμονισινών (FUM) σε δύσπεπτο σιτηρέσιο. Το δύσπεπτο σιτηρέσιο καταρτίστηκε ως μοντέλο που ευνοεί την εντερική δυσβίωση στα παχυνόμενα ορνίθια. Συνολικά 378 αρσενικά ορνίθια κρεοπαραγωγής (Ross 308) κατανεμήθηκαν τυχαία σε 3 πειραματικές επεμβάσεις για 39 ημέρες οι οποίες ήταν: DS (δύσπεπτο σιτηρέσιο) χωρίς άλλες προσθήκες που χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας, DS με προσθήκη DON (5 mg / kg σιτηρεσίου) και DS με προσθήκη FUM (20 mg / kg σιτηρεσίου). Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν στην παραπάνω μελέτη έγινε την ανάλυση διασποράς ANOVA. Βρέθηκε ότι ο ΡΑΣΒ και η ΚΤ διέφεραν σημαντικά μεταξύ των επεμβάσεων. Συγκεκριμένα, τα ορνίθια των επεμβάσεων DON και FUM είχαν χαμηλότερο (P = 0.002) ΡΑΣΒ σε σύγκριση το DS. Επιπλέον, η επέμβαση FUM μείωσε σημαντικά την ΚΤ (P = 0.018) σε σύγκριση με την επέμβαση DS. Με την προσθήκη της DON το μονοπάτι που αφορά την αποτοξίνωση ενεργοποιήθηκε γονιδιακά στον δωδεκαδάκτυλο, στη νήστιδα και στον ειλεό, ενώ η αντιοξειδωτική δράση έδειξε να επηρεάζεται αρνητικά στον ειλεό και στα τυφλά. Επιπροσθέτως, η επέμβαση FUM έδειξε να επηρεάζει κυρίως τη γονιδιακή έκφραση στο δωδεκαδάκτυλο και στα τυφλά. Στον δωδεκαδάκτυλο συγκεκριμένα, αυξήθηκαν τα γονίδια που αφορούν την ανοσιακή απόκριση (TLR4, NFkB1) ενώ στα τυφλά επηρεάστηκε αρνητικά η αντιοξειδωτική δράση με την προσθήκη των φουμονισινών. Συμπερασματικά, η έκφραση κρίσιμων βιοδεικτών που σχετίζονται με την εντερική ακεραιότητα και λειτουργία, βρέθηκε ότι επηρεάστηκε σημαντικά από τον τύπο του σιτηρεσίου και συγκεκριμένα από τις προδιαγραφές του σε μεταβολιστέα ενέργεια και ολική πρωτεΐνη, καθώς και από τη σύσταση του σιτηρεσίου με λιγότερο εύπεπτες ζωοτροφές. Επιπρόσθετα, σημαντική επίδραση επί των βιοδεικτών που μελετήθηκαν είχε η προσθήκη φυτικών βιοενεργών συστατικών καθώς και η παρουσία μυκοτοξινών στη τροφή. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής δημιουργήθηκε νέα γνώση σχετικά με το πρόσημο και την ένταση της έκφρασης γονιδίων σχετικών με τον εντερικό φραγμό και τους μηχανισμούς αποτοξίνωσης, αντιοξειδωτικής άμυνας, ανοσιακής απόκρισης, κυτταρικής απόπτωσης και πρωτεϊνοσύνθεσης. Είναι σημαντικό ότι οι ανωτέρω επιδράσεις χαρτογραφήθηκαν κατά μήκος του εντέρου των κρεοπαραγωγών ορνιθίων αποκαλύπτοντας όχι μόνο τον τρόπο αλλά και τον τόπο δράσης των παραγόντων που μελετήθηκαν.