Νέες προοπτικές της θεραπευτικής δράσης των βιοφαινολών του ελαιολάδου σε παρασιτικά νοσήματα: διερεύνηση μοριακών ρυθμιστικών ανοσολογικών μηχανισμών

Abstract

Leishmaniasis is a multisystemic parasitic disease with a wide range of clinical symptoms, including chronic inflammation of skin and internal visceral organs, and can be fatal if left untreated. It affects 12 million people worldwide, while 0.7 - 1.2 million new cases are annually reported from nearly 100 endemic countries. Leishmaniasis is endemic in Southern Europe with a progressively increasing incidence in non-endemic areas, posing a public health problem. It is caused by more than 21 different species of unicellular protozoan parasites of the genus Leishmania (family Trypanosomatidae), which are transmitted to their final vertebrate hosts through the blood meal of infected female insects belonging to the family of Psychodidae (genus Phlebotomus and Lutzomyia), and infect the host's mononuclear phagocytes. The main hosts of the parasite are humans, species of the canine family and rodents. The severity of clinical manifestations of the disease depends on both the species of the parasite and the genetic predisposition and immunocompetence of the infected host, as has been demonstrated in the available experimental animal models. Since no effective vaccine is available, chemotherapy is the only treatment option for the disease. Available chemotherapy and combination therapies include drugs such as pentamidine, paromomycin, azoles, liposomal amphotericin B and miltefosine. However, all these options present severe drawbacks, such as toxicity, high cost and an increasing failure rate, mainly due to the development of protozoan resistance, which necessitates the investigation of new active antileishmanial substances and new effective treatment protocols. Recent epidemiological studies show that Mediterranean Diet (MD) is associated with a reduced incidence of chronic inflammatory diseases such as cardiovascular diseases, neurological disorders and certain types of cancer. The main ingredient of MD is olive oil, and in particular extra virgin olive oil (EVOO), which comes from the plant Olea europaea L. Numerous studies in in vitro and in vivo models of various diseases, claim that the beneficial effects of olive oil are attributed to monounsaturated fatty acids (MUFAs) and to its polar fraction (total phenolic fraction, TPF), which contains chemical classes of biophenols, such as phenyl alcohols, phenolic acids, secoiridoids, flavonoids and lignans. Thus, the consumption of olive oil, as an indispensable product of MD, is strongly associated with beneficial health benefits, such as antioxidant, anti-inflammatory and anti-cancer properties. Recently, the European Food Safety Committee (EFSA) has issued on the positive contribution of olive oil biophenols to human health. Therefore, the investigation of the role of these bioactive molecules of olive oil in the treatment of endemic infectious diseases in Southern European countries, which are the main oil-producing countries with the highest overall consumption of olive oil, is of special scientific interest. The aim of this PhD thesis was the comparative study of the antileishmanial properties of two total phenolic fractions, TPF1 and TPF2, with different polyphenolic composition, derived from Greek EVOOs, and their association, as well as their main isolated polyphenolic components association with the commercially available antileishmanial drug miltefosine (HePC), in in vitro and in vivo experimental models of leishmaniasis. The quantitative analysis revealed that TPF2 was richer in phenolic compounds as it contained hydroxytyrosol (HT) (5 mg/g of extract), tyrosol (T) (12 mg/g), oleacein (OLEA) (144 mg/g) and oleocanthal (OLEO) (301 mg/g), while TPF1 contained HT and T at 7 and 42 mg/g of extract, respectively. Both TPF1 and TPF2, exerted potent antileishmanial activity against two species of the genus Leishmania, L. infantum and L. major, which are the causative agents of the visceral and cutaneous forms of the disease, respectively. However, TPF2 was demonstrated as the most potent antileishmanial compound. Similarly, the isolated polyphenolic compounds oleuropein (OLE), HT, OLEA and OLEO demonstrated significant antileishmanial activity in both models. Also, except OLE, all tested compounds showed low toxicity against macrophages and selectivity against Leishmania spp.In order to delineate the possible differential mode of action of the two total phenolic fractions, studies aimed to determine the type of induced cell death in Leishmania spp. promastigotes. In particular, various characteristic morphological and biochemical markers of apoptosis were determined in Leishmania spp. parasites. Due to the parasite's growing resistance to antileishmanial medications that have been used for many decades, new potent therapeutic agents or combination therapy regimens are urgently requested. In recent years, drug combinations have been increasingly advocated as a way to increase efficacy, reduce the duration and the cost of treatment and limit the occurrence of drug resistance. In this thesis, the interactions of each biophenolic compound with HePC were evaluated in vitro, with the ultimate goal of optimizing the effect of HePC, the only oral formulation approved for the treatment of leishmaniasis. This correlation was performed using the modified isobologram method, and the results revealed additivity for HePC-TPF1 and HePC-TPF2 interactions, synergy for HePC-OLEO, indifference for HePC-HT and HePC-OLEA and antagonism for HePC-OLE, in both L. infantum and L. major promastigotes. Among these, the results leading to synergy and additivity were characterized as the most promising, as they induced a significant reduction in the required dose of HePC. These promising interactions were further confirmed by the enhanced intracellular ROS production in extracellular promastigotes. These results led to further investigation of the nature of the interactions of these compounds on intracellular amastigotes, and the results revealed antagonism in both species of the parasite. Furthermore, the three biophenolic compounds TPF1, TPF2, and OLEO were also highlighted for their immunomodulatory action in an in vitro system of Leishmania - infected macrophages, which in most cases was enhanced when combined with HePC. These results characterized OLEO as the most promising molecule and drove to its further investigation in an in vivo experimental model of cutaneous leishmaniasis, in order to evaluate both its single and combined with HePC therapeutic effect. Overall, the results obtained from the present PhD thesis verified that total phenolic fractions of olive oil are bioactive extracts with potent antileishmanial and immunomodulatory activity. In addition, they revealed that fractions richer in the phenolic compounds OLEA and OLEO, esters of HT and T, respectively, possess stronger antileishmanial activity. This assumption was further confirmed by the investigation of the leishmanicidal activity of the isolated polyphenols, where OLEO gave the most promising results among the studied pure compounds. Moreover, the association of these bioactive natural components with HePC showed a promising new therapeutic approach against Leishmania parasites, indicating that such approaches can determine potentially effective treatment regimens associated with optimal lower dose of the standard drug. Combination chemotherapy encourages future pursuit of this strategy for treating disease in difficult clinical relapses, in patients who do not respond to the initial available chemotherapy, and in complex situations such as HIV co-infection.

Η λεϊσμανίαση αποτελεί μία πολυσυστηματική παρασιτική νόσο με ένα ευρύ φάσμα κλινικών συμπτωμάτων, όπως χρόνιων φλεγμονών του δέρματος και των σπλαγχνικών οργάνων, που μπορεί να είναι θανατηφόρος αν δεν θεραπευτεί έγκαιρα. Επηρεάζει 12 εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως, ενώ 0,7 - 1,2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις αναφέρονται ετησίως από σχεδόν 100 ενδημικές χώρες. Πρόκειται για μια ενδημική νόσο της Νοτίου Ευρώπης με προοδευτικά αυξανόμενη συχνότητα και στις μη ενδημικές περιοχές, θέτοντας πρόβλημα δημόσιας υγείας. Προκαλείται από περισσότερα από 21 διαφορετικά είδη μονοκύτταρων πρωτόζωων παρασίτων του γένους Leishmania, της οικογένειας των τρυπανοσωματιδών (Trypanosomatidae), που μεταδίδονται στους τελικούς σπονδυλωτούς ξενιστές τους μέσω του δήγματος των μολυσμένων θηλυκών εντόμων της οικογένειας των ψυχοειδών (γένη Phlebotomus και Lutzomyia), τα οποία εισερχόμενα στην κυκλοφορία του αίματος μολύνουν τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα του ξενιστή. Κύριοι ξενιστές του παρασίτου αποτελούν ο άνθρωπος, είδη της οικογένειας των κυνιδών και τα τρωκτικά. Η βαρύτητα των κλινικών εκδηλώσεων της νόσου εξαρτάται τόσο από το είδος του παρασίτου, όσο και από την γενετική προδιάθεση και την ανοσοϊκανότητα του προσβεβλημένου ξενιστή, όπως αυτό αποδεικνύεται στα μοντέλα ζωικών προτύπων που είναι διαθέσιμα. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει εμπορικά διαθέσιμο αποτελεσματικό εμβόλιο, η χημειοθεραπεία αποτελεί τη μόνη θεραπευτική επιλογή για τη νόσο. Οι διαθέσιμες χημειοθεραπείες και συνδυαστικές θεραπείες περιλαμβάνουν φάρμακα, όπως η πενταμιδίνη, η παρομομυκίνη, διάφορες αζόλες, η λιποσωμιακή αμφοτερικίνη Β και η μιλτεφοσίνη. Ωστόσο, όλες αυτές οι επιλογές παρουσιάζουν σημαντικές παρενέργειες, όπως τοξικότητα, υψηλό κόστος και αυξανόμενο ποσοστό αποτυχίας, που οφείλεται κυρίως στην ανάπτυξη αντοχής του παρασίτου. Συνεπώς, καθίσταται αναγκαία η διερεύνηση νέων δραστικών αντιλεϊσμανιακών ουσιών και νέων αποτελεσματικών πρωτοκόλλων θεραπείας. Σύγχρονες επιδημιολογικές μελέτες αναδεικνύουν πως η Μεσογειακή διατροφή συνδέεται με μειωμένη συχνότητα εμφάνισης χρόνιων φλεγμονωδών νοσημάτων όπως, καρδιαγγειακές παθήσεις, νευρολογικές διαταραχές και ορισμένοι τύποι καρκίνου. Βασικό συστατικό της αποτελεί το ελαιόλαδο και ειδικότερα το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο (extra virgin olive oil, EVOO), το οποίο προέρχεται από το φυτό Olea europaea L. Πολυάριθμες μελέτες σε in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα αποδίδουν τις ευεργετικές επιδράσεις του ελαιολάδου στα μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (monounsaturated fatty acids, ΜUFAs) και στο πολικό του κλάσμα (total phenolic fraction, TPF), στο οποίο εμπεριέχονται ποικίλες βιοφαινόλες, όπως φαινυλικές αλκοόλες, φαινολικά οξέα, σεκοϊριδοειδή, φλαβονοειδή και λιγνάνες. Συνεπώς, η κατανάλωση ελαιολάδου, του ακρογωνιαίου λίθου της Μεσογειακής διατροφής, συσχετίζεται με ευεργετικές για την υγεία ιδιότητες, όπως αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις και αντικαρκινικές. Πρόσφατα, η Ευρωπαϊκή Επιτροπή Ασφάλειας Τροφίμων (EFSA) γνωμοδότησε σχετικά με τη θετική συμβολή των βιοφαινολών του ελαιολάδου στην υγεία του ανθρώπου. Επομένως, η διερεύνηση του ρόλου αυτών των βιοδραστικών μορίων του ελαιόλαδου στη θεραπεία ενδημικών λοιμωδών νοσημάτων, στις χώρες της Νοτίου Ευρώπης που είναι οι κύριες ελαιοπαραγωγικές χώρες παγκοσμίως με την υψηλότερη κατά κεφαλή κατανάλωση ελαιολάδου, είναι ιδιαίτερου επιστημονικού ενδιαφέροντος. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η συγκριτική μελέτη των αντιλεϊσμανιακών ιδιοτήτων δύο ολικών φαινολικών κλασμάτων, TPF1 και TPF2, προερχόμενα από ελληνικά EVOOs, με διαφορετική πολυφαινολική σύσταση, καθώς και η συσχέτιση τόσο αυτών όσο και τεσσάρων βασικών απομονωμένων πολυφαινολικών τους συστατικών, με το εμπορικά διαθέσιμο αντιλεϊσμανιακό φάρμακο μιλτεφοσίνη (HePC), σε in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα της νόσου. Η ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι το TPF2 ήταν πλουσιότερο σε φαινολικές ενώσεις, καθώς περιείχε υδροξυτυροσόλη (HT) (5 mg/g εκχυλίσματος), τυροσόλη (Τ) (12 mg/g), ολεασεΐνη (OLEA) (144 mg/g) και ολεοκανθάλη (OLEO) (301 mg/g), ενώ το TPF1 περιείχε ΗΤ και Τ στα 7 και 42 mg/g εκχυλίσματος, αντίστοιχα. Παρά τη διαφορετική τους φαινολική σύσταση, και τα δύο TPF άσκησαν ισχυρή αντιλεϊσμανιακή δράση έναντι δύο ειδών του γένους Leishmania, των L. infantum και L. major, τα οποία αποτελούν αιτιολογικούς παράγοντες της σπλαγχνικής και της δερματικής μορφής της νόσου, αντίστοιχα. Ωστόσο, το TPF2 επέδειξε ισχυρότερες αντιλεϊσμανιακές ιδιότητες. Ομοίως, οι απομονωμένες πολυφαινολικές τους ενώσεις, ολευρωπεΐνη (OLE), HT, OLEA και OLEO, επέδειξαν σημαντική αντιλεϊσμανιακή δράση και στα δύο μοντέλα. Επίσης, με εξαίρεση την OLE, όλες οι εξεταζόμενες ουσίες εμφάνισαν χαμηλή τοξικότητα έναντι των μακροφάγων και σαφή εκλεκτικότητα έναντι του Leishmania spp. Η παρούσα διατριβή στη συνέχεια εστίασε στη συγκριτική μελέτη των δύο ολικών φαινολικών κλασμάτων, προσδιορίζοντας τον τύπο του επαγόμενου κυτταρικού θανάτου σε προμαστιγώτες Leishmania spp. Ειδικότερα, στους εξωκυττάριους προμαστιγώτες προσδιορίστηκαν χαρακτηριστικοί μορφολογικοί και βιοχημικοί δείκτες αποπτωτικού θανάτου.Η αυξανόμενη ανθεκτικότητα του παρασίτου στα διαθέσιμα αντιλεϊσμανιακά φάρμακα που χρησιμοποιούνται για πολλές δεκαετίες, οδηγεί αναπόφευκτα στην αναζήτηση νέων αποτελεσματικών θεραπευτικών ουσιών ή συνδυαστικών δοσολογικών σχημάτων. Τα τελευταία χρόνια η συνδυαστική χρήση φαρμάκων υποστηρίζεται όλο και περισσότερο ως ένας τρόπος για την αύξηση της αποτελεσματικότητας, τη μείωση της διάρκειας και του κόστους της θεραπείας και τον περιορισμό της ανθεκτικότητας. Στην παρούσα διατριβή αξιολογήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις καθεμίας βιοφαινολικής ένωσης με τη HePC, με απώτερο στόχο τη βελτιστοποίηση της απόδοσης της HePC, του μοναδικού εγκεκριμένου από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) σκευάσματος που χορηγείται δια στόματος για τη θεραπεία της λεϊσμανίασης. Η αξιολόγηση της φύσης της αλληλεπίδρασης πραγματοποιήθηκε σε in vitro συστήματα εξωκυττάριων προμαστιγωτών και ενδοκυττάριων αμαστιγωτών Leishmania, με βάση την τροποποιημένη μέθοδο ισοβολογράμματος. Τα αποτελέσματα στο σύστημα των προμαστιγωτών L. infantum και L. major αποκάλυψαν αθροιστικότητα για τις αλληλεπιδράσεις HePC-TPF1 και HePC-TPF2, συνέργεια για την αλληλεπίδραση HePC-OLEΟ, αδιαφορία για HePC-HT και HePC-OLEA και ανταγωνισμό για HePC-OLE. Μεταξύ αυτών, τα αποτελέσματα που οδήγησαν σε συνέργεια και αθροιστικότητα χαρακτηρίστηκαν ως τα πιο υποσχόμενα, καθώς προκάλεσαν σημαντική μείωση στη δοσολογία της HePC. Οι υποσχόμενες αυτές αλληλεπιδράσεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω από την ενισχυμένη ενδοκυττάρια παραγωγή ROS στους εξωκυττάριους προμαστιγώτες. Ακολούθησε η διερεύνηση του είδους των αλληλεπιδράσεών τους με τη HePC και στο σύστημα των ενδοκυττάριων αμαστιγωτών, όπου τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ανταγωνισμό και στα δύο είδη του παρασίτου. Επιπλέον, σε in vitro σύστημα Leishmania – μολυσμένων μακροφάγων αναδείχθηκε η ανοσορυθμιστική δράση και των τριών βιοφαινολικών ενώσεων, TPF1, TPF2 και OLEO, η οποία στην πλειονότητα των δοκιμασιών ενισχύθηκε όταν οι ενώσεις αυτές συνδυάστηκαν με τη HePC. Το σύνολο των ανωτέρω αποτελεσμάτων ανέδειξε την OLEO ως το πιο πολλά υποσχόμενο μόριο και οδήγησε στην επιλογή της για την περαιτέρω εφαρμογή της σε in vivo πειραματικό μοντέλο δερματικής λεϊσμανίασης, προκειμένου να αξιολογηθεί τόσο η μονήρης, όσο και η συνδυαστική με τη HePC θεραπευτική της δράση. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης επαλήθευσαν ότι τα ολικά φαινολικά κλάσματα του ελαιολάδου αποτελούν βιοενεργά εκχυλίσματα με ισχυρή αντιλεϊσμανιακή και ανοσοτροποποιητική δράση. Επιπλέον, ανέδειξαν ότι τα κλάσματα που είναι πλουσιότερα στις φαινολικές ενώσεις OLEA και OLEO, εστέρες των ΗΤ και Τ, αντίστοιχα, έχουν ισχυρότερη αντιλεϊσμανιακή δράση. Η παραδοχή αυτή επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τη διερεύνηση της λεϊσμανιοκτόνου δράσης των απομονωμένων πολυφαινολών, όπου η OLEO έδωσε τα πιο υποσχόμενα αποτελέσματα μεταξύ των υπό μελέτη καθαρών ενώσεων. Επίσης, η συσχέτιση των βιοενεργών φυσικών συστατικών με τη HePC, έδειξε μία υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση έναντι των παρασίτων, υποδεικνύοντας νέα θεραπευτικά πρωτόκολλα που μπορούν να καθορίσουν πιθανά αποτελεσματικά δοσολογικά σχήματα που σχετίζονται με τη βέλτιστη χαμηλότερη δόση του τυπικού φαρμάκου. Η στρατηγική της συνδυαστικής χημειοθεραπείας ενθαρρύνει την μελλοντική επίτευξη αυτής της στρατηγικής για την αντιμετώπιση της νόσου σε δύσκολες κλινικές περιπτώσεις υποτροπών, σε περιπτώσεις ασθενών που δεν ανταποκρίνονται στην αρχική διαθέσιμη χημειοθεραπεία, καθώς και σε περίπλοκες καταστάσεις όπως η συλλοίμωξη με τον ιό HIV.