Μελέτη αλληλεπιδράσεων ακόρεστων λιπαρών οξέων με την αλβουμίνη ορού και την αντι-αποπτωτική πρωτεϊνη Bcl-2 με έμφαση στη χρήση μεθοδολογιών NMR κυτταρικού επιπέδου (in-cell NMR)

Abstract

Fatty acids (FAs) are the main building blocks of complex lipids. Their transport into the systemic circulation and their distribution to tissues is achieved with the carrier protein serum albumin (BSA/HSA). X-ray crystallography and NMR studies with human serum albumin suggested the presence of seven fatty acid binding sites. Binding site 7 (FA7) coincides with site I of drugs (warfarin), while binding site 3 (FA3) with site II of drugs (ibuprofen).Recent studies of antitumor activity of the essential ω-3 and ω-6 FFAs demonstrated the reduction of expression levels of the anti-apoptotic protein Bcl-2. This result combined with the structural similarity of unsaturated FFAs to Bcl-2 inhibitors indicates the pro-apoptotic action of FFAs as a possible mechanism. However, the structural features of the interaction of FFAs with Bcl-2 as well as the mechanism of their antitumor activity remain unknown. The objectives of the PhD thesis were to investigate using modern NMR methodologies: (a) the molecular basis of the interaction of unsaturated FFAs with non-labelled serum albumin, (b) the non-covalent vs. covalent binding of nitro-derivatives of oleic acid with HSA, (c) the molecular basis of the interaction of polyunsaturated fatty acids with Bcl-2 and (d) the structural and conformational features of the interactions of the polyunsaturated fatty acid DHA with Bcl-2, at the cellular level in living cancer cells overexpressing the receptor. Saturation transfer difference (STD), transferred nuclear Overhauser effect (Tr-NOESY) and Interligand NOEs for PHArmacophore Mapping (INPHARMA) NMR techniques and docking calculations were applied, for the first time, for mapping interactions and specific binding sites of caproleic acid, oleic acid, linoleic acid, α-linolenic acid, EPA and DHA with non-labelled serum albumin. Competition experiments with the drugs warfarin and ibuprofen showed significant inter-ligand NOEs between the FFAs and the drugs, reflecting the conformational states of the fatty acids in the drug binding sites on HSA, regardless of the carbon chain length and the number of the cis double bonds of FFAs. The inter-ligand NOEs and docking calculations were interpreted in terms of significant folding of the bis-allylic region and the presence of two orientations of the FFAs in the warfarin binding site, due to two anchoring groups of polar amino acids. This motional flexibility is the reason that the conformational states of the FFAs in the binding site of warfarin could not be determined precisely, despite numerous literature X-ray structural studies. The NMR study of the interaction of 9/10-nitro-oleic acid (9/10-NO2-OA) with serum albumin demonstrated the non-covalent binding of 9/10-NO2-OA to HSA. Competition experiments with oleic acid and the drugs ibuprofen and warfarin revealed that 9/10-NO2-OA has higher binding affinity for HSA than oleic acid and warfarin, while with ibuprofen it has a similar binding affinity. The combination of STD and tr-NOESY NMR techniques was used to investigate the interaction of FFAs with the anti-apoptotic protein Bcl-2 in buffer solution. Competition experiments of FFAs with the sub-nanomolar inhibitor ABT-263 showed a cooperative interaction, with the exception of EPA which showed antagonistic interaction. In-cell NMR methodology was used, for the first time, to investigate the interaction of DHA with the anti-apoptotic protein Bcl-2 in living Jurkat Bcl-2 tumor cells overexpressing the receptor. It turned out that DHA enters the cells and interacts nearly exclusively with Bcl-2 and not with other protein receptors. Competition experiment of DHA with the inhibitor ABT-263 showed an antagonistic interaction, contrary to the cooperative interaction with Bcl-2 in buffer solution.

Τα λιπαρά οξέα αποτελούν τις κύριες δομικές μονάδες των σύνθετων λιπιδίων. Η μεταφορά τους στη συστηματική λειτουργία και η κατανομή τους στους ιστούς επιτυγχάνεται με τη μεταφέρουσα πρωτεΐνη αλβουμίνη (BSA/HSA). Με τη χρήση κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ και φασματοσκοπίας NMR έχει βρεθεί ότι υπάρχουν επτά θέσεις πρόσδεσης των λιπαρών οξέων στην αλβουμίνη. Η θέση πρόσδεσης 7 (FA7) συμπίπτει με τη θέση Ι των φαρμάκων (βαρφαρίνη), ενώ η θέση πρόσδεσης 3 (FA3) με τη θέση ΙΙ των φαρμάκων (ιβουπροφαίνη). Πρόσφατες μελέτες αντικαρκινικής δράσης των απαραίτητων ω-3 και ω-6 λιπαρών οξέων, απέδειξαν τη μείωση των επιπέδων έκφρασης της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2. Το αποτέλεσμα αυτό σε συνδυασμό με τη δομική ομοιότητα των ακόρεστων λιπαρών οξέων με αναστολείς της Bcl-2 υποδεικνύει την προ-αποπτωτική δράση των λιπαρών οξέων ως πιθανό μηχανισμό. Όμως, τα δομικά χαρακτηριστικά αλληλεπίδρασης των λιπαρών οξέων με την Bcl-2 καθώς και ο μηχανισμός της αντικαρκινικής τους δράσης παραμένει άγνωστος. Βασικοί στόχοι της διδακτορικής διατριβής, με τη χρήση σύγχρονων μεθοδολογιών NMR, είναι η διερεύνηση: (α) της μοριακής βάσης αλληλεπίδρασης ακόρεστων FFA με μη επισημασμένη αλβουμίνη ορού, (β) της μη ομοιοπολικής έναντι της ομοιοπολικής πρόσδεσης νιτρο-παραγώγων του ελαϊκού οξέος με HSA, (γ) της μοριακής βάσης αλληλεπίδρασης πολυακόρεστων FFA με την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 και (δ) δομικών και διαμορφωτικών χαρακτηριστικών αλληλεπιδράσεων πολυακόρεστου λιπαρού οξέος DHA με τη Bcl-2, σε κυτταρικό επίπεδο σε ζωντανά καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα. Εφαρμόστηκε, για πρώτη φορά, η συνδυαστική χρήση τεχνικών NMR διαφοράς μεταφοράς κορεσμού (STD), μεταφερόμενου φαινομένου Overhauser (Tr-NOESY), διαμοριακών σημάτων ΝΟΕ για φαρμακοφόρο χαρτογράφηση (INPHARMA) και υπολογισμών docking με στόχο τη μελέτη αλληλεπιδράσεων των λιπαρών οξέων καπρολεϊκού οξέος, ελαϊκού οξέος, λινελαϊκού οξέος, α-λινολενικού οξέος, EPA και DHA με μη επισημασμένη αλβουμίνη ορού. Με τη χρήση ανταγωνιστικών πειραμάτων με τα φάρμακα βαρφαρίνη και ιβουπροφαίνη παρατηρήθηκαν σημαντικά διαμοριακά ΝΟΕ μεταξύ των λιπαρών οξέων και των φαρμάκων, που αντανακλούν τις διαμορφωτικές καταστάσεις των λιπαρών οξέων στις θέσεις πρόσδεσης των φαρμάκων στην HSA. Τα διαμοριακά σήματα ΝΟΕ και οι υπολογισμοί docking ερμηνεύτηκαν σε όρους σημαντικής αναδίπλωσης της δις-αλλυλικής περιοχής και παρουσίας δύο προσανατολισμών των λιπαρών οξέων στη θέση πρόσδεσης της βαρφαρίνης, λόγω ύπαρξης δύο ομάδων πολικών αμινοξέων που έχουν το ρόλο μοριακής άγκυρας. Αυτή η διαμορφωτική ευελιξία των λιπαρών οξέων στη θέση πρόσδεσης της βαρφαρίνης είναι ο κύριος λόγος για τον οποίο δεν κατέστη δυνατός ο ακριβής προσδιορισμός με ακτίνες-Χ, παρά τις πολυάριθμες βιβλιογραφικές δομικές μελέτες. NMR μελέτες της αλληλεπίδρασης του 9/10-νιτρο-ελαϊκού οξέος (9/10-ΝΟ2-ΟΑ) με την αλβουμίνη ερμηνεύτηκαν σε όρους μη ομοιοπολικής πρόσδεσης του 9/10-ΝΟ2-ΟΑ στην HSA. Με τη χρήση ανταγωνιστικών πειραμάτων του ελαϊκού οξέος και των φαρμάκων ιβουπροφαίνης και βαρφαρίνης διαπιστώθηκε ότι το 9/10-NO2-OA έχει υψηλότερη συγγένεια πρόσδεσης στην HSA σε σχέση με το ελαϊκό οξύ και τη βαρφαρίνη, ενώ με την ιβουπροφαίνη έχει παρόμοια συγγένεια πρόσδεσης. Με τη συνδυαστική χρήση των τεχνικών STD και tr-NOESY NMR διερευνήθηκε η αλληλεπίδραση των λιπαρών οξέων με την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 σε διάλυμα buffer. Ανταγωνιστικά πειράματα των FFA με τον αναστολέα ABT-263 ερμηνεύτηκαν σε όρους συνεργατικής αλληλεπίδρασης, με εξαίρεση το EPA που έδειξε ανταγωνιστική δράση. Η μεθοδολογία in-cell NMR χρησιμοποιήθηκε, για πρώτη φορά, στη μελέτη αλληλεπίδρασης του DHA με την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 σε ζωντανά καρκινικά κύτταρα Jurkat Bcl-2 που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα. Αποδείχθηκε ότι το DHA εισέρχεται στα κύτταρα και αλληλεπιδρά σχεδόν αποκλειστικά με τη Bcl-2 και όχι με άλλους πρωτεϊνικούς υποδοχείς. Ανταγωνιστικό πείραμα του DHA με τον αναστολέα ABT-263 έδειξε ανταγωνιστική αλληλεπίδραση, σε αντίθεση με τη συνεργατική αλληλεπίδραση με Bcl-2 σε διάλυμα buffer.