NMR διαμορφωτική ανάλυση δραστικών πεπτιδίων που σχετίζονται με τον αυξητικό παράγοντα πλειοτροπίνη

Abstract

Pleiotrophin (PTN) is an 18 kDa growth factor and is highly homologous to Midkine (MK), forming together a growth factor family with high affinity to heparin. Recent studies suggest that pleiotrophin highly regulates the levels of expression of the genes encoding the proteins of the renin-angiotensin pathway in mouse aorta. The 3D structure of PTN has not yet been resolved and the aim of this dissertation is to provide structural data of active peptide fragments of pleiotrophin and related biomolecules. Specifically, it reports the conformational study of several factors involved in the renin-angiotensin system. Homology modeling of pleiotrophin based on the related midkine protein structure suggests that the first domain of pleiotrophin consists of three antiparallel β-strands and the second domain of two antiparallel β-strands, proposing a general rule for proteins holding a thrombospondin type I repeat (TSR) sequence motif. Circular dichroism (CD) measurements of the overexpressed and purified, native, PTN confirm the presence of the characteristic β-structures in the protein. The structural study of PTN peptide fragments, PTN9-59, PTN60-110 and PTN112-136, through the use of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy along with the Chemical Shift Index (CSI) analysis conclude in similar content of β-structure. PTN9-59 and PTN60-110 peptides are expected to form β-sheets while PTN112-136 seems to adopt a random coil structure. The following step of the dissertation was the conformational study of 37- and 46-aminoacids peptides which are representatives of the N- and C-catalytic sites of Angiotensin-I Converting Enzyme (ACE), during their interaction with their natural substrates Angiotensin I and Bradykinin. Furthermore, the interaction has been studied through titration experiments in order to elucidate the structural and the physicochemical factors, which govern the interaction between ACE-Angiotensin I and ACE-Bradykinin. Angiotensin I undergoes structural changes during its interaction with both N- and C-catalytic sides of ACE, but/though in a different way or to a different extent. The structural comparison of Bradykinin among the three studied states (in its free state and during its interaction with ACEN/C-46_Zn peptides) provides evidence that Bradykinin interacts in a greater extent with the C-catalytic site of ACE.

Η πλειοτροπίνη (PTN) είναι ένας αυξητικός παράγοντας 18 kDa και εμφανίζει μεγάλη ομολογία με τη Midkine (MK), με την οποία σχηματίζουν μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων, που έχουν υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη. Πρόσφατες μελέτες αποκαλύπτουν τη συσχέτιση της με το σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνης, αποδεικνύοντας ότι η πλειοτροπίνη ρυθμίζει τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες-κλειδιά του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης στην αορτή μυών. Η τριτοταγής δομή της πρωτεΐνης δεν έχει μέχρι σήμερα αποσαφηνιστεί και η παρούσα εργασία επιχειρεί να συμβάλει προς την κατεύθυνση αυτή με την εξαγωγή δομικών πληροφοριών για δραστικά τμήματα της πλειοτροπίνης, καθώς και για άλλους παράγοντες που σχετίζονται με τη βιολογική τους δράση και εμπλέκονται στο σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνης. Η προσομοίωση μέσω ομολογίας της πλειοτροπίνης, χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την ομόλογη της Midkine, αποκάλυψε ότι η πρώτη κεντρική περιοχή οργανώνεται σε τρεις και η δεύτερη σε δυο αντιπαράλληλες β-πτυχωτές επιφάνειες, προτείνοντας ένα γενικό κανόνα για τις ακολουθίες που περιέχουν TSR (thrombospondin type I repeat) μοτίβα. Η σύσταση της β’ ταγούς δομής της ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης, όπως αυτή προέκυψε από την ανάλυση των φασμάτων κυκλικού διχρωϊσμού, επιβεβαίωσε την ύπαρξη μεγάλου ποσοστού β-πτυχωτών φύλλων. Το τελευταίο στάδιο δομικής προσέγγισης της πλειοτροπίνης αποτέλεσε η NMR ανάλυση πεπτιδικών τμημάτων της πλειοτροπίνης, PTN9-59, PTN60-110 και PTN112-136. Τα εξαγώγιμα αποτελέσματα σε συνδυασμό με την ανάλυση του δείκτη χημικών μετατοπίσεων προτείνουν το σχηματισμό β-πτυχωτών επιφανειών για τα πεπτίδια PTN9-59 και PTN60-110, ενώ το PTN112-136 υιοθετεί δομή τυχαίου σπειράματος. Ακολούθησε η λεπτομερής διαμορφωτική ανάλυση των πεπτιδικών τμημάτων 37 και 46 αμινοξέων, που αντιπροσωπεύουν το N- και C- καταλυτικό κέντρο του Μετατρεπτικού Ενζύμου της Αγγειοτενσίνης, καθώς και των φυσικών του υποστρωμάτων αγγειοτενσίνη Ι και βραδυκινίνη. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε η μελέτη του δομικού πλαισίου της αλληλεπίδρασης με τα φυσικά του υποστρώματα, η οποία κατέδειξε τις δομικές διαφοροποιήσεις που επάγονται και στα δυο καταλυτικά κέντρα κατά την αλληλεπίδραση. Η αγγειοτενσίνη Ι υφίσταται δομική διαφοροποίηση κατά την αλληλεπίδραση της με τα ACEN/C-46_Zn πεπτίδια, αλληλεπιδρώντας όμως με διαφορετικό τρόπο ή σε διαφορετικό ποσοστό με τα δυο καταλυτικά κέντρα του ACE. Η σύγκριση της δομικής διαφοροποίησης που υφίσταται η βραδυκινίνη στις τρεις μελετώμενες καταστάσεις παρέχει σαφείς ενδείξεις ότι η βραδυκινίνη αλληλεπιδρά εκτενέστερα με το C- καταλυτικό κέντρο του ACE.