Pulsed Electric Fields (PEF) as microalgae pretreatment in the context of a biorefinery

Abstract

Microalgae are photosynthetic microorganisms with a wide array of applications due to their diverse output. They can contribute to the transition from fossil fuels to more environment friendly ones, they offer opportunities for the development of chemicals or other high value products and they can be utilized for nutrient purposes or animal feed. An efficient exploitation of the entire biomass is a major challenge for the large-scale adaptation of the microalgae by the industry. A commonly cited problem is the need for an efficient pre-treatment method that would overcome the natural resistance of the microalgae to extraction. Pulse Electric Fields (PEF) is one such method, proven to effect on freshly harvested, wet microalgae cells. This results in a release of the intracellular water-soluble components into the surrounding aquatic medium. Hydrophobic components such as lipids remain in the cells and can be subsequently extracted with the addition of organic solvents. It is evident thus, that PEF could play a role in a potential microalgae biorefinery. The exact mechanism of PEF effect on the microalgae however, is still under investigation. Moreover, it has been observed that the time lapsed after PEF-treatment is an important parameter with an effect on the product yields. This waiting period, henceforth dubbed ‘incubation’ is essentially the first step in the biorefinery scheme, since it overlaps with the water-soluble release and its closer examination is necessary. The goal of this study was to evaluate PEF as pre-treatment method for microalgae with a focus on the lipid extraction and to assess the impact of incubating the biomass after treatment on the downstream process. Auxenochlorella protothecoides (A. protothecoides), cultivated autotrophically, was used as model alga due to its high lipid content and highly resistive cell wall. The biomass was incubated after PEF at inert conditions (in dark, at 23 °C, without agitation and after flashing with N2) for 24 h. Lipid extraction was performed on wet biomass utilizing 76 mL/g dry biomass of an ethanol:hexane:water (1: 0.41: 0.04 vol/vol/vol) monophasic solvent mixture with 24 h duration, in the dark and constant agitation.Untreated A. protothecoides proved indeed quite resistant to intracellular extraction. No water-soluble components were detected in the water fraction and lipid yields were negligible. The respective results after PEF, immediately after treatment, were dependent on the treatment energy. After 25 kJ/L, ~3.2 g/L carbohydrates were detected in the water-fraction compared to ~8.4 g/L for 150 kJ/L. Approximately ~5 % dry weight lipids were extracted from biomass treated with 25 kJ/L and ~32 % from biomass with 150 kJ/L. However, a 24 h-incubation step after PEF-treatment led to much improved results particularly for 25 kJ/L with a carbohydrate release 8.1 g/L and lipid yields ~31 % dry weight. Carbohydrate release for 150 kJ/L remained relatively stable at 8.9 g/L and the lipid yields were increased up to 38 % dry weight. Incubation of microalgae after PEF-treatment could therefore lead to increased yields and allow for the reduction of the treatment energy by a factor 6 with comparable results. The lipid profile and pigment content of the microalgae were also analyzed with gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Neither PEF-treatment nor incubating the biomass afterwards had any degrading effect on the profile of the above compounds, assuring the stability of the product’s quality.The microalgae cell structure and the cell wall more specifically were examined in order to elucidate the PEF-treatment mechanism. Inspection of microalgae cells with scanning electron microscopy (SEM) showed no visible deformation on their surface. Incubation significantly affect the lipid extraction rates. For freshly treated biomass, after 10 min of extraction, ~6 % dry weight lipids were extracted even at 150 kJ/L treatment energy. If the biomass was incubated after PEF, ~30 % dry weight lipids were extracted for the same period, followed by a subsequent slight yield increase over a period of 18 h.This extraction acceleration could be interpreted as a first indication of cell wall degradation, the main barrier to lipid extraction as acknowledged within the community, after PEF-treatment. Finally, an energy evaluation for the extraction of 1 L of lipids was performed in order to identify steps in need of improvement and evaluate the impact of incubation after PEF. Utilizing experimental data, six scenarios were formed depending on the inclusion of incubation, treatment energy and extraction duration with formulas and energy demand for each processing step adapted from literature. Solvent recycling was the major bottleneck, representing more than 90 % of the energy requirement, in particular the separation of ethanol-water azeotrope. In every case, the overall Energy consumption ratio (ECR) was quite high, with the lowest value equal to 11.5, corresponding to 24 h incubation, 24 h extraction duration and 150 kJ/L. For the further upscaling of the process therefore, it is important to reduce the solvent volume used.The evolution of the biomass over incubation after PEF allowed alternative extraction pathways to be tested. Extraction with 37 mL/g dry biomass of an ethanol:hexane:water biphasic mixture (1:6:0.4 vol/vol/vol), met with limited success, with approximately 27 % dry weight lipid yields, but only for incubated biomass. In spite of the modest yields, The ECR for 1 L of lipids in this case was significantly reduced to 2.3, mainly due to the minimization of ethanol, something which opens new opportunities and potential reevaluation of the overall lipid extraction approach.

Τα μικροφύκη είναι φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί με ένα μεγάλος εύρος εφαρμογών λόγω της ποικιλόμορφης σύσταση τους. Τα μικροφύκη μπορούν να συμβάλουν στη μετάβαση από τα ορυκτά καύσιμα σε φιλικότερα προς το περιβάλλον, προσφέρουν ευκαιρίες για την ανάπτυξη χημικών ή άλλων προϊόντων υψηλής αξίας και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για θρεπτικούς σκοπούς ή για ζωοτροφές.Η αποτελεσματική εκμετάλλευση ολόκληρης της βιομάζας αποτελεί σημαντική πρόκληση για τη εκμετάλλευση σε μεγάλη κλίμακα των μικροφυκών από τη βιομηχανία. Ένα σύνηθες πρόβλημα είναι η ανάγκη για μια αποτελεσματική μέθοδο προεπεξεργασίας που μπορεί να υπερνικήσει τη φυσική αντίσταση των μικροφυκών στην εκχύλιση. Τα παλμικά ηλεκτρικά πεδία (ΠΗΠ) είναι μια τέτοια μέθοδος, η οποία έχει αποδειχτεί ως αποτελεσματική σε φρέσκα, υγρά μικροφύκη. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση των ενδοκυτταρικών υδατοδιαλυτών συστατικών στο περιβάλλον υδάτινο μέσο. Υδρόφοβα συστατικά όπως τα λιπίδια και τριγλυκερίδια παραμένουν στα κύτταρα και μπορούν στη συνέχεια να εκχυλιστούν με την προσθήκη οργανικών διαλυτών. Είναι προφανές λοιπόν ότι τα ΠΗΠ θα μπορούσαν να παίξουν ρόλο σε ένα πιθανό βιοδιυλιστήριο μικροφυκών.Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός της επίδρασης των ΠΗΠ στα μικροφύκη είναι ακόμα υπό διερεύνηση. Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι ο χρόνος που παρήλθε μετά την επεξεργασία με ΠΗΠ είναι μια σημαντική παράμετρος με επίδραση στις αποδόσεις του προϊόντος. Αυτή η περίοδος αναμονής ή αλλιώς «επώαση», είναι ουσιαστικά το πρώτο στάδιο σε ένα βιοδιυλιστήριο, καθώς συμπίπτει με την απελευθέρωση των υδατοδιαλυτών συστατικών κάτι που καθιστά μια προσεκτική εξέτασή της απαραίτητη. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει τα ΠΗΠ ως μέθοδο προεπεξεργασίας για μικροφύκη με έμφαση στην εκχύλιση λιπιδίων και να αξιολογήσει τον αντίκτυπο της επώασης της βιομάζας στην διαδικασία επεξεργασίας.Η Auxenochlorella protothecoides (A. protothecoides), που καλλιεργήθηκε αυτοτροφικά, χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο αναφοράς λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς του σε λιπίδια και του ιδιαίτερα ανθεκτικού κυτταρικού τοιχώματος που έχουν. Η βιομάζα επωάστηκε μετά από ΠΗΠ σε αδρανείς συνθήκες (χωρίς φωτισμό, στους 23 °C και χωρίς ανάδευση) για 24 ώρες. Η εκχύλιση λιπιδίων πραγματοποιήθηκε σε υγρή βιομάζα χρησιμοποιώντας 76 mL/g ξηρής βιομάζας ενός μονοφασικού μίγματος διαλυτών αιθανόλης:εξανίου:νερού (1:0,41:0,04 vol/vol/vol) με διάρκεια 24 ωρών, στο σκοτάδι και συνεχή ανάδευση.Το στέλεχος A. protothecoides χωρίς καμία προεπεξεργασία αποδείχθηκε πράγματι αρκετά ανθεκτικό στην ενδοκυτταρική εκχύλιση. Δεν ανιχνεύθηκαν υδατοδιαλυτά συστατικά στο υδάτινο κλάσμα και η εκχύλιση λιπιδίων ήταν αμελητέα. Τα αντίστοιχα αποτελέσματα μετά από ΠΗΠ, χωρίς επώαση, καθορίστηκαν από το μέγεθος της ενέργειας που εφαρμόστηκε στα μικροφύκη. Με 25 kJ/L, ανιχνεύθηκαν ~3,2 g/L υδατάνθρακες στο κλάσμα νερού σε σύγκριση με ~8,4 g/L για 150 kJ/L. Περίπου ~5% λιπίδια επί ξηρού βάρους εκχυλίστηκαν από βιομάζα που είχε υποστεί προεπεξεργασία με 25 kJ/L και ~32% από βιομάζα με 150 kJ/L. Ωστόσο, ένα στάδιο επώασης 24 ωρών μετά την επεξεργασία με ΠΗΠ οδήγησε σε πολύ βελτιωμένα αποτελέσματα, ιδιαίτερα για την 25 kJ/L ενέργεια, με απελευθέρωση υδατανθράκων 8,1 g/L και αποδόσεις λιπιδίων ~31 % ξηρού βάρους. Η απελευθέρωση υδατανθράκων για 150 kJ/L παρέμεινε σχετικά σταθερή στα 8,9 g/L και οι αποδόσεις λιπιδίων αυξήθηκαν έως και 38% ξηρό βάρος. Η επώαση των μικροφυκών μετά την επεξεργασία με ΠΗΠ θα μπορούσε επομένως να οδηγήσει σε αυξημένες αποδόσεις και να οδηγήσει σε μείωση της ενέργειας επεξεργασίας έως 6 φορές διατηρώντας παρόμοια αποτελέσματα.Το προφίλ των λιπιδίων καθώς και η περιεκτικότητα σε χρωστικές ουσίες των μικροφυκών αναλύθηκαν με αέρια χρωματογραφία (GC) και υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Δεν παρατηρήθηκε κάποια επιβλαβή επίδραση στα παραπάνω μετά από την προεπεξεργασία με ΠΗΠ ή την εικοσιτετράωρη επώαση της βιομάζας, επιβεβαιώνοντας έτσι την διασφάλιση της ποιότητας του προϊόντος.Η δομή των κυττάρων των μικροφυκών καθώς και το κυτταρικό τοίχωμα αυτών μελετήθηκαν περαιτέρω προκειμένου να διευκρινιστεί ο μηχανισμός προεπεξεργασίας με ΠΗΠ. Η επιθεώρηση των κυττάρων με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) δεν έδειξε κάποια αισθητή παραμόρφωση στην επιφάνειά τους. Η επώαση βρέθηκε να επηρεάζει σημαντικά τους ρυθμούς εκχύλισης λιπιδίων. Για βιομάζα επεξεργασμένη με ΠΗΠ και χωρίς επώαση, μετά από 10 λεπτά εκχύλισης, ~6% λιπιδίων επί ξηρής βάσης εκχυλίστηκαν ακόμη και σε ενέργεια επεξεργασίας 150 kJ/L. Με επώαση μετά από ΠΗΠ, ~30% λιπίδια επί ξηρής βάσης εκχυλίστηκαν για την ίδια περίοδο, ακολουθούμενη από μια επακόλουθη ελαφρά αύξηση της απόδοσης σε μια περίοδο 18 ωρών. Αυτή η επιτάχυνση της εκχυλίσεως θα μπορούσε να ερμηνευθεί ως μια πρώτη ένδειξη αποικοδόμησης του κυτταρικού τοιχώματος μετά από επεξεργασία με ΠΗΠ, του κύριου εμποδίου στην εκχύλιση λιπιδίων.Τέλος, διενεργήθηκε μια εκτίμηση της απαιτούμενης ενέργειας για την εκχύλιση 1 λίτρου λιπιδίων προκειμένου να εντοπιστούν τα βήματα που χρήζουν βελτίωσης και να αξιολογηθεί ο αντίκτυπος της επώασης μετά τα ΠΗΠ. Χρησιμοποιώντας πειραματικά δεδομένα, διαμορφώθηκαν έξι σενάρια ανάλογα με τη συμπερίληψη της επώασης, της ενέργειας επεξεργασίας με ΠΗΠ και της διάρκειας εκχύλισης με εξισώσεις και ενεργειακές απαιτήσεις για κάθε στάδιο επεξεργασίας, προσαρμοσμένες από τη βιβλιογραφία. Η ανακύκλωση των οργανικών διαλυτών είχε την μεγαλύτερη απαίτηση, αντιπροσωπεύοντας περισσότερο από το 90 % της ενεργειακής κατανάλωσης και κυρίως ο διαχωρισμός αιθανόλης- νερού. Σε κάθε περίπτωση, ο συνολικός δείκτης κατανάλωσης ενέργειας (ΔΚΕ) ήταν αρκετά υψηλός, με τη χαμηλότερη τιμή ίση με 11,5, που αντιστοιχεί σε 24 ώρες επωάσεως, 24 ώρες εκχύλισης και 150 kJ/L ενέργεια επεξεργασίας.Επομένως, για την περαιτέρω αναβάθμιση της διαδικασίας, είναι σημαντικό να μειωθεί ο όγκος των χρησιμοποιούμενων οργανικών διαλυτών. Η αποδόμηση της βιομάζας κατά την επώαση μετά τα ΠΗΠ επέτρεψε τη δοκιμή εναλλακτικών τεχνικών εκχύλισης. Η εκχύλιση με 37 mL/g ξηρής βιομάζας ενός διφασικού μίγματος αιθανόλης:εξανίου:νερού (1:6:0,4 vol/vol/vol), είχε περιορισμένη επιτυχία, με αποδόσεις λιπιδίων περίπου 27% επι ξηρό βάρος, αλλά μόνο για επωασμένη βιομάζα. Παρά τις μέτριες αποδόσεις, ο ΔΚΕ για 1 λίτρο λιπιδίων σε αυτή την περίπτωση μειώθηκε σημαντικά σε 2,3, κυρίως λόγω της ελαχιστοποίησης της χρησιμοποιούμενης αιθανόλης. Το τελευταίο αυτό αποτέλεσμα καθιστά την εκχύλιση λιπιδίων από μικροφύκη ανταγωνιστικότερη και ανοίγει νέες προοπτικές βελτίωσης της.