Μελέτη μεθόδων παραλαβής καροτινοειδών από παραπροϊόντα τομάτας

Abstract

The objective of the present thesis is to study the recovery methods of carotenoids from tomato processing by-products, in order to be used as naturalantioxidants or as additives for the formulation of functional foods. Fresh tomato industrial waste (from industrial hybrids Red Sea and Oval Red) was air dried and ground to 1.0 mm particle size. Organic solvent extraction has been studied as the most established method for the recovery of carotenoids in food industry and the parameters affecting the extraction yield were determined. The organic solvents used were hexane, acetone,ethanol, ethyl acetate and ethyl lactate. The effect of time (5-40 min) on carotenoid extraction from tomato waste was investigated by conducting experiments during the first extraction step in all the above mentioned solvents, at 25 °C. A mathematic equation describing the prediction rate of carotenoids in each solvent was determined and the equation parameters as well as the respective correlation coefficients were estimated by nonlinear regression analysis. Carotenoid concentration increased with time, approaching a quasi-saturated condition at approximately 30 min of extraction; therefore, the extraction time of 30 min was chosen for adequate recovery of carotenoids at each extraction step. The extraction temperature (25 °C-70 °C) was chosen on the basis of the boiling point of solvents avoiding possible isomerization and/or oxidation of carotenoids. The extraction yield was significantly affected (P < 0.05) by the increase in extraction temperature. The extraction efficiency was affected by the solvent type and its polarity. Ethyl lactate presented remarkably higher yields, compared to the other solvents, which was increased (from 202.73 to 243.00 mg kg-1 dry tomato waste), as extraction temperature increased from 25 °C to 70 °C. The other solvents showed much lower yields in the following order: acetone (51.90 mg kg-1) > ethyl acetate (46.21 mg kg-1) > hexane (34.45 mg kg-1) > ethanol (17.57 mg kg-1), at the maximum selected extraction temperatures. The effect of successive extraction steps on the carotenoid recovery was subsequently examined, in all the selected solvents and temperatures. For all the solvents, the first extraction step turned out to be the controlling one, in terms of carotenoid yield and percentage recovery. The use of medium polar or nonpolar solvents (ethyl acetate and hexane) increased the percentage recovery of carotenoids (70-74 %) in the first extraction step, compared to the respective one (55-68 %) obtained by more polar solvents (acetone and ethanol). During the third extraction step, the carotenoid percentage recovery was less than 10 % in all solvents, except ethanol, and could eventually be omitted. Following the experimental study, the extraction yield of tomato waste carotenoids was assessed in mixtures of nonpolar and polar solvents, namely, hexaneethanol (50:50, v/v), hexane-acetone (50:50, v/v) and hexane-ethyl acetate (50:50, v/v) mixtures. The combination of hexane with ethanol or ethyl acetate improved the total carotenoid yield compared with that obtained by any of the individual solvents. The highest carotenoid yield was obtained when carotenoids were extracted with hexaneethyl acetate (50:50, v/v) mixture. Extraction conditions, such as mixture composition, solvent to waste ratio and particle size were further optimized using a statistically designed experiment. By means of Responsive Surface Methodology and experimentalBox-Behnken design, a regression equation for predicting the carotenoid yield as a function of three extraction variables was derived and a model with predictive ability of 0.97 was obtained. The optimized conditions for maximum total carotenoid yield (37.5 mg kg-1 dry waste) were the following: hexane-ethyl acetate (45:55, v/v) mixture, solvent to waste ratio of 9.1:1 (v/w) and particle size 0.56 mm. A HPLC-DAD was developed for the efficient separation and analysis of the carotenoids and their cis-isomers, originating from a wide range of foods of plant, animal and marine origin. The identified carotenoids in all solvent extracts from dry tomato waste followed the order: lycopene > b-carotene > lutein, in their predominant trans-configuration. Among the identified isomers, 5-cis lycopene and 15-cis-bcarotene were the most abundant in all solvent extracts. The increase of extraction temperature increased the respective αll-trans lycopene concentration in all solvent extracts, whereas the percentage of cis-isomers to total lycopene (αll-trans + cis) was lower than 8 % in all solvent extracts, other than ethanol (20.0 %) and acetone (17.3 %) extracts, at 70 °C and 50 °C, respectively. A steadily high percentage of cis-isomer (≈30.4 %) was observed upon increasing the temperature from 25 °C to 70 °C in ethyl lactate extracts. Conversely, the increase of extraction temperature induced a reduction in total b-carotene and total lutein concentration in all solvents, but did not cause any further isomerization. The next field under investigation was the influence of drying and storage conditions on the recovery and stability of carotenoids, especially lycopene, obtained from fresh tomato processing by-products. The dehydration treatment was performed as following in the four methods: (a) air-drying at room temperature (25 °C -30 °C), (b) air circulation oven at 70 °C, (c) vacuum oven at 70 °C and (d) freeze-drying. The drying method affected significantly lycopene isomerization with a considerable increase of cis-isomers and a simultaneous reduction of all-trans configurations. Fresh tomato waste contained mainly αll-trans lycopene (99.7 %), while the cis-isomers were absent (0.3 %). The storage of fresh tomato processing by-products at -20 °C for 60 days caused a degradation of total lycopene content by 13.5 % compared to the fresh tomato waste, while a small percentage of isomerization was observed (2.4 %) during storage. Further research aimed at the investigation of enhancing carotenoid extractability by enzyme pretreatment of industrial tomato processing by-products, in fresh and dry state, prior to solvent enzymes chosen for treatment were cellulase (Cellulyve AN 3500) and pectinase (Pectinex Ultra AFP). After determination of the improved incubation conditions for both enzymes (cellulase and pectinase concentrations of 70 U/g and 122.5 U/g, respectively, and incubation time 180 min for both enzymes), the effect of enzyme treatment combined with different extraction solvents on total carotenoid yield and lycopene content was furtherinvestigated. The treatment with pectinase increased the extraction of total carotenoids and especially of lycopene, compared to cellulase, when hexane and ethyl lactate were used as solvents. The enzyme treatment of fresh industrial tomato waste prior to extraction with ethyl lactate improved significantly lycopene content, compared with the respective of the conventional extraction (with the same solvent, without enzyme treatment) in the first extraction step. An equivalent effect was not observed with the other extraction solvents. Nevertheless, the higher lycopene recovery (88.0 %) obtained from fresh tomato waste, as compared with the respective one obtained by conventional extraction (with the same solvent in 3 extraction steps), was observed after enzyme treatment with pectinase and hexane-ethyl acetate (50:50,v/v) mixture as extraction solvent. In the context of exploring "environmentally friendly" extraction techniques, the extraction with supercritical carbon dioxide was studied. Extractions were performed at P=250 and 295 bar, T=55 °C and 65 °C, flow CO2=2.0 mL/min, and extraction time=3 h. The oleoresin and carotenoid yields were compared with therespective ones obtained by Soxhlet extraction with hexane: acetone (1:1, v/v) mixture. The maximum recoveries of all-trans lycopene (15.3 %) and all-trans bcarotene (11.5 %), as compared with those of Soxhlet extraction, were achieved at P=295 bar and T=65 °C. It was concluded that the examined conditions were not sufficient for the recovery of significant amount of carotenoids. The application of High Hydrostatic Pressure technology (HHP) for extracting carotenoids from tomato waste constitutes a new field for exploration and development. Factors influencing the effectiveness of the method [solvent type, pressure: 100-800 MPa, extraction time: 1-30 min and solvent: waste ratio (4:1, 6:1, 10:1, v/w)] were examined and compared with the conventional extraction with thesame solvent. The improved conditions of high pressure treatment were determined (P=700 MPa, t=10 min) and were selected as the processing parameters enabling the highest total carotenoid extraction yield. Generally, high pressure assisted extraction was performed in a shorter treatment time (10 min) and a lower solvent: waste ratio, compared to atmospheric pressure extraction with the same solvents, without significantly affecting the extraction yields. The results of the present thesis evidence the existence of interesting alternative perspectives to traditional classical extraction for carotenoid recovery from low cost raw materials. However, further parameters should be explored and evaluated economically in order to make feasible their industrial implementation.

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτελεί η μελέτη των μεθόδων ανάκτησης των καροτενοειδών από παραπροϊόντα βιομηχανικής επεξεργασίας τομάτας, προκειμένου να αξιοποιηθούν ως φυσικά αντιοξειδωτικά ή ως πρόσθετα για τη σύνθεση λειτουργικών τροφίμων. Χρησιμοποιήθηκε νωπό παραπροϊόν βιομηχανικής επεξεργασίας τομάτας (από υβρίδια βιομηχανικής τομάτας Red Sea και Oval Red), το οποίο ξηράνθηκε στον αέρα και αλέσθηκε σε κοκκομετρία 1.0 mm. Η εκχύλιση με χρήση οργανικών διαλυτών μελετήθηκε ως η πλέον καθιερωμένη μέθοδος ανάκτησης καροτενοειδών στη βιομηχανία τροφίμων και προσδιορίστηκαν οι παράμετροι που επηρεάζουν την απόδοση της εκχύλισης. Οι οργανικοί διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το εξάνιο, η ακετόνη, η αιθανόλη, ο οξικός αιθυλεστέρας και ο γαλακτικός αιθυλεστέρας. Η χρονική διάρκεια της εκχύλισης (5 40 min) μελετήθηκε με διεξαγωγή πειραμάτων με όλους τους προαναφερόμενους διαλύτες στο πρώτο στάδιο της εκχύλισης και σε θερμοκρασία 25 °C. Προσδιορίστηκε μαθηματική εξίσωση πρόβλεψης του ρυθμού εκχύλισης των καροτενοειδών για κάθε διαλύτη και με ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης υπολογίστηκαν οι παράμετροι της εκθετικής εξίσωσης και οι αντίστοιχοι συντελεστές συσχέτισης. Επιλέχθηκε ο χρόνος των 30 min για την επαρκή ανάκτηση των καροτενοειδών στα επόμενα πειράματα και σε κάθε στάδιο της εκχύλισης. Η θερμοκρασία της εκχύλισης (25 °C-70 °C) επιλέχθηκε με κριτήριο το σημείο ζέσεως των διαλυτών εκχύλισης και την αποφυγή τυχόν ισομερίωσης ή/και οξείδωσης των καροτενοειδών. Παρατηρήθηκε ότι η αύξηση της θερμοκρασίας εκχύλισης συνοδεύτηκε γενικά από στατιστικά σημαντική (P<0.05) αύξηση της απόδοσης της εκχύλισης. Το είδος και η πολικότητα του διαλύτη επηρέασαν την αποτελεσματικότητα της εκχύλισης. Τα εκχυλίσματα του γαλακτικού αιθυλεστέρα παρουσίασαν αξιοσημείωτα υψηλές αποδόσεις σε ολικά καροτενοειδή, συγκριτικά με τα εκχυλίσματα των υπόλοιπων διαλυτών και κυμάνθηκαν από 202.73-243.00 mg kg-1 ξηρού παραπροϊόντος , με την αύξηση της θερμοκρασίας από 25 °C-70 °C, αντίστοιχα. Οι λοιποί διαλύτες παρουσίασαν πολύ μικρότερες αποδόσεις ακολουθώντας τη σειρά: ακετόνη (51.90 mg kg-1) > οξικός αιθυλεστέρας (46.21 mg kg-1) > εξάνιο (34.45 mg kg-1) > αιθανόλη (17.57 mg kg-1), στις μέγιστες επιλεγμένες θερμοκρασίες εκχύλισης. Η επίδραση των διαδοχικών σταδίων εκχύλισης στην ανάκτηση τωνκαροτενοειδών μελετήθηκε στους επιλεγμένους διαλύτες και θερμοκρασίες. Αποδείχθηκε ότι το πρώτο στάδιο εκχύλισης είναι το πλέον καθοριστικό για την απόδοση σε ολικά καροτενοειδή. Η χρήση μέτρια πολικών ή μη πολικών διαλυτών (οξικός αιθυλεστέρας ή εξάνιο) αύξησε το ποσοστό ανάκτησης των καροτενοειδών (70-74 %) στο πρώτο στάδιο της εκχύλισης, συγκριτικά με το αντίστοιχο ποσοστό (55-68 %) που παραλήφθηκε όταν χρησιμοποιήθηκαν πιο πολικοί διαλύτες (ακετόνη και αιθανόλη). Στο τρίτο στάδιο της εκχύλισης η ανάκτηση ήταν μικρότερη του 10 % των ολικών καροτενοειδών σε όλους τους διαλύτες, εκτός της αιθανόλης, και θα μπορούσε ενδεχομένως να παραληφθεί. Στη συνέχεια της πειραματικής διατριβής εξετάστηκαν εκχυλίσεις σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με μίγματα πολικών-μη πολικών διαλυτών, συγκεκριμένα, μίγμα εξανίου-αιθανόλης (50:50, v/v), εξανίου-ακετόνης (50:50, v/v) και εξανίου-οξικού αιθυλεστέρα (50:50, v/v) ως προς την απόδοσή τους σε ολικά καροτενοειδή και βρέθηκε ότι ο συνδυασμός του εξανίου με την αιθανόλη ή τον οξικό αιθυλεστέρα βελτίωσε την απόδοση σε ολικά καροτενοειδή, συγκριτικά με την αντίστοιχη των μεμονωμένων διαλυτών. Η μεγαλύτερη απόδοση παρατηρήθηκε όταν τα καροτενοειδή εκχυλίστηκαν με μίγμα εξανίου-οξικού αιθυλεστέρα (50:50, v/v). Περαιτέρω, με μεθοδολογία αποκριτικών επιφανειών και πειραματικό σχεδιασμό BoxBehnken προσδιορίστηκε πολυωνυμική εξίσωση που συσχετίζει την απόδοση σε ολικά καροτενοειδή με τις τρεις μεταβλητές επεξεργασίας (σύνθεση μίγματος, αναλογία μίγματος διαλυτών: παραπροϊόντος και κοκκομετρία ξηρού αλεσμένου παραπροϊόντος). Η μέγιστη απόδοση σε ολικά καροτενοειδή (37.5 mg kg-1 ξηρού παραπροϊόντος τομάτας) επιτεύχθηκε με εκχύλιση με μίγμα εξανίου-οξικού αιθυλεστέρα (45:55, v/v), αναλογία διαλύτη: παραπροϊόντος (9.1:1, v/w) και μέγεθος σωματιδίων (0.56 mm). Προκειμένου να γίνει διαχωρισμός, ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση των καροτενοειδών και των ισομερών διαμορφώσεών τους, αναπτύχθηκε μέθοδος υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC) που βρήκε εφαρμογή σε ευρύ φάσμα τροφίμων φυτικής, ζωικής και θαλάσσιας προέλευσης. Τα καροτενοειδή που ταυτοποιήθηκαν σε όλα τα εκχυλίσματα των διαλυτών από ξηρά παραπροϊόντα τομάτας ήταν με τη σειρά: λυκοπένιο > β-καροτένιο > λουτεΐνη, στην επικρατέστερη all-trans διαμόρφωσή τους. Από τα ισομερή που ταυτοποιήθηκαν, το 5-cis λυκοπένιο και το 15-cis-β-καροτένιο ήταν τα ποσοτικά επικρατέστερα σε όλα τα εκχυλίσματα. Η αύξηση της θερμοκρασίας εκχύλισης αύξησε την αντίστοιχη συγκέντρωση του αll trans λυκοπένιου σε όλους τους διαλύτες, ενώ τα ποσοστά των cis-ισομερών λυκοπένιου σε σχέση με το ολικό λυκοπένιο (αll-trans + cis) παρέμειναν μικρότερα του 8 %, εκτός από τα εκχυλίσματα αιθανόλης (20.0 %) και ακετόνης (17.3 %) στους 70 °C και 50 °C, αντίστοιχα. Σταθερό και υψηλό ποσοστό cis-ισομερών (≈30.4 %) παρατηρήθηκε κατά την αύξηση της θερμοκρασίας από 25 °C στους 70 °C στα εκχυλίσματα γαλακτικού αιθυλεστέρα. Αντίθετα, η αύξηση της θερμοκρασίας εκχύλισης προκάλεσε μείωση της συγκέντρωσης του ολικού β-καροτένιου και της ολικής λουτεΐνης σε όλους τους διαλύτες, ενώ δεν προκάλεσε ισομερίωση πέραν της αρχικής. Η επίδραση της ξήρανσης και της αποθήκευσης του νωπού παραπροϊόντος βιομηχανικής επεξεργασίας τομάτας (τσίπουρο) στην ανάκτηση και τη σταθερότητα των καροτενοειδών, ειδικότερα του λυκοπένιου, ήταν ο επόμενος στόχος της πειραματικής διατριβής. Η ξήρανση έγινε με 4 μεθόδους: α) στον αέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (25-30 °C), β) σε φούρνο κυκλοφορίας αέρα (70 °C), γ) σε φούρνο κενού (70 °C) και δ) με λυοφιλίωση. Οι συγκεκριμένες μέθοδοι ξήρανσης προκάλεσαν μικρές διαφοροποιήσεις στην περιεκτικότητα του ολικού λυκοπένιου, η μεγαλύτερη απώλεια λυκοπένιου σημειώθηκε μετά την ξήρανση σε φούρνο αέρα και σε αέρα και η μικρότερη απώλεια μετά τη λυοφιλίωση. Η μέθοδος ξήρανσης επέδρασε σημαντικά στην ισομερίωση του λυκοπένιου με σημαντική αύξηση των cisισομερών και ταυτόχρονη μείωση των all-trans διαμορφώσεων. Τα νωπά παραπροϊόντα τομάτας περιείχαν κυρίως all-trans λυκοπένιο (99.7 %), ενώ τα cisισομερή σχεδόν απουσίαζαν (0.3 %) από τη νωπή πρώτη ύλη. Η αποθήκευση των νωπών παραπροϊόντων βιομηχανικής επεξεργασίας τομάτας σε θερμοκρασία -20 °C για 60 ημέρες προκάλεσε υποβάθμιση του ολικού λυκοπενίου κατά 13.5 % σε σχέση με τη νωπή πρώτη ύλη, ενώ παρατηρήθηκε μικρό ποσοστό ισομερίωσης (2.4 %) κατά την αποθήκευση. Η περαιτέρω έρευνα στόχευε στη διερεύνηση της αύξησης της απόδοσης των καροτενοειδών με ενζυμική προκατεργασία των παραπροϊόντων βιομηχανικής επεξεργασίας τομάτας, σε νωπή και ξηρή κατάσταση, πριν από την εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες. Τα ένζυμα που επιλέχθηκαν ήταν κυτταρινάση (Cellulyve AN 3500) και πηκτινάση (Pectinex Ultra AFP). Αφού προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες δράσης των ενζύμων (συγκεντρώσεις πηκτινάσης και κυτταρινάσης, 70 U/g και 122.5 U/g, αντίστοιχα και χρόνος ενζυμικής κατεργασίας 180 min), μελετήθηκε η επίδραση της συνδυασμένης δράσης της ενζυμικής κατεργασίας και των διαφορετικών διαλυτών εκχύλισης στην απόδοση σε ολικά καροτενοειδή και στην περιεκτικότητα σε λυκοπένιο. Η κατεργασία με την πηκτινάση, συγκριτικά με εκείνητης κυτταρινάσης, ενίσχυσε την εκχύλιση των ολικών καροτενοειδών και ειδικότερα του λυκοπένιου, όταν οι διαλύτες εκχύλισης ήταν το εξάνιο και ο γαλακτικός αιθυλεστέρας. Η ενζυμική κατεργασία νωπών παραπροϊόντων βιομηχανικής επεξεργασίας τομάτας πριν την εκχύλιση με γαλακτικό αιθυλεστέρα βελτίωσε σημαντικά την απόδοση σε λυκοπένιο, συγκρινόμενη με την αντίστοιχη απόδοση της συμβατικής εκχύλισης (με τον ίδιο διαλύτη, χωρίς ενζυμική κατεργασία) στο 1ο στάδιο εκχύλισης. Αντίστοιχο αποτέλεσμα δεν παρατηρήθηκε με τους άλλους διαλύτες. Εν τούτοις, η μεγαλύτερη ανάκτηση του λυκοπένιου από νωπά παραπροϊόντα βιομηχανικής επεξεργασίας τομάτας (88.0 %), συγκρινόμενη με τη συμβατική εκχύλιση με τον ίδιο διαλύτη σε 3 στάδια, παρατηρήθηκε μετά από ενζυμική κατεργασία με πηκτινάση και εκχύλιση με εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (50:50, v/v). Στα πλαίσια της διερεύνησης «φιλικών προς το περιβάλλον» μεθόδων εκχύλισης, μελετήθηκε η εκχύλιση με υπερκρίσιμο διοξείδιο του άνθρακα. Πραγματοποιήθηκαν εκχυλίσεις σε P=250 και 295 bar, Τ= 55 °C και 65 °C, ροή CO2= 2.0 mL/min, και είχαν διάρκεια 3 h. Οι αποδόσεις σε ελαιορητίνη και σε καροτενοειδή συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες εκχυλίσεων Soxhlet με μίγμα εξάνιου: ακετόνης (1:1, v/v). Η μέγιστη ανάκτηση all-traφαρμογή της τεχνολογίας υns λυκοπένιου (15.3 %) και all-trans β-καροτένιου (11.5 %) συγκριτικά με τη μέθοδο Soxhlet επιτεύχθηκε σε συνθήκες P=295 bar και T=65 °C. Επομένως οι συνθήκες που μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή δεν επαρκούν για την ανάκτηση σημαντικής ποσότητας καροτενοειδών. H εφαρμογή υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης (ΥΥΠ) για την εκχύλιση καροτενοειδών από τα παραπροϊόντα αποτελεί ένα πεδίο προς διερεύνηση και ανάπτυξη. Εξετάστηκαν παράγοντες που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της μεθόδου (διαλύτης, πίεση: 100-800 MPa, χρόνος εκχύλισης: 1-30 min και αναλογία διαλύτη: πρώτης ύλης: 4:1. 6:1, 10:1) σε σύγκριση με τη συμβατική μέθοδο με τον ίδιο διαλύτη. Προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης με υπερυψηλή πίεση (P=700 MPa, t=10 min) και επιλέχθηκαν ως εκείνες που δίνουν τη μέγιστη απόδοση σε ολικά καροτενοειδή. Γενικά, η εκχύλιση με χρήση υπερυψηλής πίεσης πραγματοποιήθηκε σε συντομότερο χρόνο επεξεργασίας (10 min) και με μικρότερηαναλογία διαλύτη: παραπροϊόντος τομάτας, συγκρινόμενη με την εκχύλιση υπό ατμοσφαιρική πίεση με τους ίδιους διαλύτες, χωρίς να επηρεαστούν σημαντικά οι αποδόσεις της εκχύλισης.Από την παρούσα διατριβή διαφαίνεται ότι υπάρχουν ενδιαφέρουσες εναλλακτικές προοπτικές στην παραδοσιακή κλασική εκχύλιση για ανάκτηση καροτενοειδών από χαμηλού κόστους πρώτες ύλες. Ωστόσο, θα πρέπει να διερευνηθούν επιπλέον παράμετροι όσο και να αξιολογηθούν οικονομικά, προκειμένου να γίνει εφικτή η βιομηχανική εφαρμογή τους.