Μελέτη σηματοδοτικών και γονιδιακών αποκρίσεων των μυοβλαστών σε μηχανική φόρτιση: ο ρόλος της γήρανσης

Abstract

Background: During aging the process of myogenesis is gradually declined and cell apoptosis increases over time. It has been shown that mechanical loading of aged skeletal muscle can ameliorate its impaired myogenic and survival potential. Yet, the molecular responses of aged muscle cells to mechanical loading remain unclear. This study examined the impact of mechanical loading of aged myoblasts on the signaling and gene expression responses associated with the progression of their myogenic lineage and survival. Methods: A model of multiple cell divisions of C2C12 myoblasts was used to replicate cell senescence. Control and aged myoblasts were investigated during myogenesis, i.e., at days 0, 2, 6 and 10 of differentiation. SA-β-gal activity and comet assay were used as markers of aging and DNA damage. Flow cytometry was performed to characterize potential differences in cell cycle between control and aged cells. Alterations in the mRNA and/or protein expression of myogenic regulatory factors (MRFs), IGF-1 isoforms, apoptotic, atrophy, inflammatory, metabolic and aging-related factors were also evaluated. Moreover, control and aged C2C12 cells were cultured on elastic membranes and underwent passive, cyclic stretching on day 0 and day 10 of differentiation. Activation of p-ERK1/2 and p-Akt, and the protein expression of FAK and the myogenic factors MyoD and Myogenin were determined by immunoblotting both in stretched and non-stretched (control) myoblasts. Quantitative RT-PCR was used to measure changes in the expression levels of the MRFs, as well as of growth, atrophy and apoptotic factors in response to mechanical loading of the C2C12 cells. Results: Compared to control cells, aged myoblasts exhibited G0/G1 cell cycle arrest, DNA damage, increased SA-β-gal activity, and increased expression of aging-related factors p16 and p21 during differentiation. Moreover, aged myoblasts showed a reduction in the expression of MRFs and metabolic/anabolic factors, along with an increased expression of apoptotic, atrophy and inflammatory factors. On the other hand, mechanical loading protocols of the aged C2C12 cells on day 0 and day 10 of their differentiation resulted in significant upregulation of protein synthesis processes. Moreover, both control and aged myoblasts exhibited a significant upregulation of of IGF-1 isoforms and MRFs, along with the downregulation of atrophy and apoptotic factors. Conclusions: A diminished differentiation capacity characterized the aged myoblasts which, in combination with the induction of apoptotic and atrophy factors, indicated a disrupted myogenic lineage in the senescent muscle cells. However, mechanical loading was beneficial for the aged myoblasts; The induction of anabolic signaling responses and the upregulation of myogenic and anabolic factors, along with the downregulation of apoptotic and atrophy factors by mechanical loading suggest an amelioration of myogenic and survival ability of the aged myotubes following mechanical stretching.

Εισαγωγή: Οι διεργασίες της μυογένεσης εμφανίζουν σταδιακή έκπτωση με τη γήρανση, ωστόσο η μηχανική φόρτιση του μυός μπορεί να αναστρέψει αυτές τις διαταραχές. Όμως, λίγα είναι γνωστά για τις μοριακές αποκρίσεις των γηρασμένων μυϊκών κυττάρων στη μηχανική τους φόρτιση. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της μηχανικής φόρτισης στη μοριακή σηματοδότηση και έκφραση γονιδίων που συνδέονται με την κυτταρική διαφοροποίηση, την υπερτροφία, ατροφία και την απόπτωση σε γηρασμένους μυοβλάστες κατά τον πολλαπλασιασμό και διαφοροποίησή τους, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο in vitro γήρανσής τους. Μεθοδολογία: Μυοβλάστες C2C12 καλλιεργήθηκαν για 60 συνεχόμενες ημέρες (80 κυτταρικούς κύκλους) με σκοπό το χαρακτηρισμό της γήρανσής τους, ενώ φυσιολογικοί μυοβλάστες χρησιμοποιήθηκαν ως συνθήκη ελέγχου. Ακολούθως, φυσιολογικά και γηρασμένα κύτταρα C2C12 καλλιεργήθηκαν σε ελαστικές μεμβράνες και υποβλήθηκαν σε διάφορα πρωτόκολλα μηχανικής φόρτισης (διάτασης) την ημέρα 0 (φάση πολλαπλασιασμού) και την 10η ημέρα διαφοροποίησής τους (τελική διαφοροποίηση), χρησιμοποιώντας το σύστημα Flexcell Tension System. Φυσιολογικοί και γηρασμένοι μυοβλάστες που δεν υποβλήθηκαν σε μηχανική φόρτιση χρησιμοποιήθηκαν ως συνθήκη ελέγχου. Για τον χαρακτηρισμό της γήρανσης των μυοβλαστών αξιολογήθηκε η δραστικότητα της β-γαλακτοσιδάσης και ελέγχθηκαν ενδεχόμενες βλάβες του DNA τους, και η έκφραση των παραγόντων p16 και p21. Κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε για να χαρακτηρίσει πιθανές διαφορές στον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση μεταξύ των φυσιολογικών και γηρασμένων μυοβλαστών. Επίσης, αξιολογήθηκαν μεταβολές της έκφρασης, σε mRNA και πρωτεϊνικό επίπεδο, των μυογενετικών ρυθμιστικών παραγόντων (MRFs - Myf5, MyoD, Myogenin, MRF4), καθώς και παραγόντων μυϊκής υπερτροφίας (ισομορφές του IGF-1), ατροφίας (Murf1, Atrogin1, Myostatin), απόπτωσης (FoxΟ1, FUCA, p53) και φλεγμονής. Επιπρόσθετα, ως προς την επίδραση της μηχανικής φόρτισης, σε διαφοροποιημένα και μη, φυσιολογικά και γηρασμένα μυϊκα κύτταρα, αξιολογήθηκαν σημαντικές σηματοδοτικές πρωτεϊνες (FAK, p-ERK1/2 και p-Akt) και οι μεταβολές της έκφρασης των ανωτέρω παραγόντων μυογένεσης, μυϊκής υπερτροφίας, ατροφίας και απόπτωσης. Για τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Αποτελέσματα: Σε σύγκριση με τα φυσιολογικά μυϊκά κύτταρα, οι γηρασμένοι μυοβλάστες εμφάνισαν αυξημένες βλάβες στο DNA, στάση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G0/G1, αυξημένη δραστικότητα της β-γαλακτοσιδάσης και αυξημένη έκφραση των παραγόντων p16 και p21 που σχετίζονται με τη γήρανση. Επιπλέον, οι γηρασμένοι μυοβλάστες εμφάνισαν μείωση της έκφρασης των μυογενετικών και των αναβολικών παραγόντων, μαζί με αυξημένη έκφραση αποπτωτικών, ατροφικών και φλεγμονωδών παραγόντων. Τα πρωτόκολλα μηχανικής φόρτισης, τόσο των φυσιολογικών όσο και των γηρασμένων C2C12 κυττάρων κατά την ημέρα 0 και 10 της διαφοροποίησής τους οδήγησαν σε σημαντική αύξηση των παραγόντων/διεργασιών πρωτεϊνοσύνθεσης. Επιπλέον, η μηχανική φόρτιση προκάλεσε αύξηση της έκφρασης των μυογενετικών παραγόντων τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα γηρασμένα κύτταρα. Επίσης, η έκφραση των ισομορφών του αυξητικού παράγοντα IGF-1 αυξήθηκε και των παράγοντων ατροφίας και απόπτωσης μειώθηκε ως αποτέλεσμα της μηχανικής φόρτισης, τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα γηρασμένα μυϊκά κύτταρα. Συμπεράσματα: Μειωμένη ικανότητα διαφοροποίησης βρέθηκε να χαρακτηρίζει τους γηρασμένους μυοβλάστες, οι οποίοι εμφάνισαν διαταραγμένη μυογενετική ικανότητα σε συνδυασμό με την αύξηση της έκφρασης αποπτωτικών και ατροφικών παραγόντων. Αντίθετα, η μηχανική φόρτιση αύξησε την έκφραση των μυογενετικών και των αυξητικών παραγόντων, ενώ παράλληλα μείωσε τους παράγοντες μυϊκής ατροφίας, γεγονός που υποδηλώνει την ενίσχυση διεργασιών μυογένεσης, τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα γηρασμένα μυϊκά κύτταρα, ως αποτέλεσμα της φόρτισης. Επίσης, η μείωση της έκφρασης των αποπτωτικών παραγόντων ενδεχομένως να αντανακλά τον περιορισμό, μέσω της μηχανικής φόρτισης, των διεργασιών προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου των μυοβλαστών.