Πεπτιδικά ανάλογα του αιμοπεταλιακού υποδοχέα IIb/IIIa: Επίδραση σε πειραματικά μοντέλα αρτηριακής θρόμβωσης

Abstract

Inhibition of platelet aggregation has been identified as a promising target for the development of new antiplatelet and antithrombotic drugs in acute coronary syndromes. We have recently identified a synthetic peptide, YMESRADR, corresponding to amino acid residues 313- 320 of the αΙΙβ subunit of platelet integrin αΙΙbβ3 that exhibits potent antiplatelet activity, in vitro. We studied the peptide’s effect on experimental thrombosis in rabbits. The animals were divided in groups (n=5 in each group) receiving intravenously a. normal saline, 6 ml/kg/h (control group), b. YMESRADR, to doses pf 3, 7.5 38 and 50 mg/kg, c. heparin 100 IU/kg/h and d. eptifibatide in two different doses: 180 μg/kg bolus plus 2 μg/kg/min (low dose) and 900 μg/kg bolus plus 10 μg/kg/min (high dose). Carotid artery thrombus formation (under continuous blood flow monitoring) was induced by electrical stimulation. Ex vivo platelet aggregation to 20 μM ADP in platelet rich plasma (PRP) and coagulation assays (thrombin time, TT; prothrombin time, PT; activated partial thromboplastin time, aPTT; fibrinogen and XIII factor levels) were determined before (baseline) and at 60 min after the initiation of drug administration (instantly prior to electrical stimulation). Ninety minutes after electrical stimulation the carotid thrombus was removed and weighed. Blood loss was calculated by the amount of blood, gathered on a pre-weighed gauge, positioned on a standardized incision, performed on the anterior abdominal wall. In the control group, carotid artery was totally occluded within 23.3±3.2 min after electrical stimulation. By contrast, in the YMESRADR (50mg), heparin and eptifibatide groups, carotid artery blood flow at 90 min after electrical stimulation, was reduced to 23,9±0,9%, 26,3%±12,7% and 36,9±5,0% (low dose), 35,3±5,1% (high dose) respectively (p<0.001 over control). Similarly, thrombus weight was significantly reduced in animals receiving YMESRADR (50 mg), heparin or eptifibatide over control: 1,66±1,18mg, 3,92±0,74mg and 1,72±0,58 mg (low dose), 2,1±1,1 mg (high dose) versus 5,72±0,86mg respectively, (p<0.003 over control). Platelet maximum aggregation to ADP in the control group, 60 min after electrical stimulation, was not altered compared to baseline, whereas it was significantly reduced by 34,3±14,5%, 28,0±6,6% (low dose), 38,3±11,0% (high dose) in the YMESRADR (15 mg/kg) and eptifibatide groups respectively, (p<0.004). There were no significant variations regarding blood loss and coagulation assays in the eptifibatide and YMESRADR groups compared to control group. We show for the first time that similarly to eptifibatide, YMESRADR reduces experimental thrombus formation in rabbits by inhibiting platelet aggregation, without influencing the blood coagulation parameters.

Η αναστολή της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων αποτελεί τον κύριο στόχο των αντιαιμοπεταλιακών φαρμάκων που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία των οξέων στεφανιαίων συνδρόμων. Έχουμε πρόσφατα συνθέσει ένα πεπτίδιο το YMESRADR, που αντιστοιχεί στην αλληλουχία 313-320 της αIIb υπομονάδας του υποδοχέα-ιντεγκρίνης των αιμοπεταλίων. Το πεπτίδιο παρουσιάζει ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δράση in vitro. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να μελετηθεί η δράση του πεπτιδίου σε πειραματικό μοντέλο αρτηριακής θρόμβωσης σε κουνέλια. Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν σε ομάδες (n=5, για την κάθε ομάδα) και έλαβαν ενδοφλέβια α. φυσιολογικό ορό (ομάδα ελέγχου), β. YMESRADR σε δόσεις 3, 7,5, 12 και 15 mg/kg, γ) ηπαρίνη σε δόση 100 IU/kg/h και δ) επτιφιμπατίδη σε δόσεις 180 μγ/kg εφάπαξ και εν συνεχεία 2 μg/kg/min (χαμηλή δόση) και 900 μg/kg εφάπαξ και στη συνέχεια 10 μg/kg/min (υψηλή δόση). Η δημιουργία θρόμβου επετεύχθη με εφαρμογή συνεχούς ηλεκτρικού ρεύματος στην κοινή καρωτίδα (υπό συνεχή καταγραφή της ροής του αγγείου). Ελήφθησαν δείγματα αίματος για τον προσδιορισμό της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων στο ADP ex vivo, και πηκτικών δοκιμασιών (χρόνος θρομβίνης ΤΤ, χρόνος προθρομβίνης PT, χρόνος μερικής θρομβοπλαστίνης aPTT, επίπεδα ινωδογόνου fg και παράγοντα ΧΙΙΙ). Επιπρόσθετα υπολογίστηκαν, το βάρος του θρόμβου (90 λεπτά μετά την εφαρμογή του ηλεκτρικού ρεύματος) και το ποσό απώλειας αίματος από δεδομένη τομή στο πρόσθιο κοιλιακό τοίχωμα. Στην ομάδα ελέγχου το αγγείο αποφράχθηκε πλήρως σε 23,3±3,2 min. Αντίθετα στις ομάδες του YMESRADR (15 mg/kg), της ηπαρίνης και της επτιφιμπατίδης η ροή στην καρωτίδα (90 λεπτά μετά την εφαρμογή ρεύματος) μειώθηκε στο 23,9±0,9%, 26,3%±12,7%, 36,9±5,0% (χαμηλή δόση), 35,3±5,1% (υψηλή δόση) της αρχικής, αντίστοιχα (p<0,001 σε σχέση με την ομάδα ελέγχου). Το βάρος του θρόμβου ήταν σημαντικά μειωμένο στις ομάδες: YMESRADR 12 και 15 mg/kg, της ηπαρίνης και της επτιφιμπατίδης έναντι της ομάδας ελέγχου: 1,66±1,18mg, 3,15±2,19, 3,92±0,74mg και 1,72±0,58 mg (χαμηλή δόση) και 2,1±1,1 mg (υψηλή δόση) έναντι 5,72±0,86mg αντίστοιχα, p<0,003). Δεν παρατηρήθηκε αναστολή της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων στην ομάδα ελέγχου προ και 60 min μετά την χορήγηση της ουσίας αντίθετα παρατηρήθηκε αναστολή κατά 34,3±14,5% και 28,0±6,6% (χαμηλή δόση) και 38,3±11,0% (υψηλή δόση) στις ομάδες του YMESRADR 15 mg/kg, και της επτιφιμπατίδης αντίστοιχα, (p<0,004).Το πεπτίδιο YMESRADR, παρόμοια με την επτιφιμπατίδη, περιορίζει σημαντικά την δημιουργία θρόμβου μέσω της αναστολής της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων σε πειραματικό μοντέλο αρτηριακής θρόμβωσης σε κουνέλια, χωρίς να επηρεάζει τους παράγοντες πήξης.