Μελέτη του ρόλου των πολυμορφισμών των γονιδίων FAS, CXCL12, TP53 και CYP1A1 στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία παιδιών και εφήβων

Abstract

Acute lymphoblastic leukemia is the most common type of leukemia in children. It accounts for one-third of all cancers diagnosed in children under 15 years old. Despite the high survival rates (overall survival over 90%), a noteworthy number of children relapse, and for them, the outcome remains poor. Epidemiological studies that examined possible risk factors for acute leukemias showed that inherited genetic variants can play an important role in leukemogenesis. Recent gene association studies for cancer risk have focused on the effects of single nucleotide polymorphisms (SNPs) of genes that are responsible for the regulation of inflammation and tumor suppression, such as chemokines, TP53 and P450 cytochrome. CXCL12 is a chemokine expressed in various tumors and its polymorphism rs1801157 may influence the ALL risk in children. The tumor protein p53 (TP53) is a tumor suppressor protein whose polymorphism rs1042522 has been studied among risk factors for malignant diseases. Additionally, previous studies have shown a possible association between SNPs of Cytochrome P450 Family 1 Subfamily A Member 1 (CYP1A1) gene and risk of leukemia. More specifically, rs1048943 of CYP1A1*2C has been reported to increase the risk of ALL in Caucasians. The FAS gene, also known as TNFSF6 / CD95 / APO-1, belongs to the family of tumor necrosis factor receptors (TNF receptors) and is one of the essential molecules of the apoptosis pathway. FAS rs2234767 polymorphism is a replacement of G from A at position -1377, which has been shown to reduce promoter activity and FAS expression levels. Decreased expression of the FAS gene leads to a decrease in FAS-mediated apoptosis and is associated with an increased risk of cancer. This polymorphism has been shown to reduce the risk of carcinogenesis.In this study, we attempt to investigate the association between genetic polymorphisms in FAS, CYP1A1, CXCL12 and TP53 genes in children and adolescent patients with ALL in the island of Crete, Greece. The case group consisted of 86 patients, children and adolescents, (51 males and 35 females) which were diagnosed with ALL in the department of Pediatric Hematology-Oncology in the University Hospital of Heraklion in Crete from 1990 to January 2018. The control group consisted of 105 adult blood donors and 20 children, from the same region of patients. Whole blood was collected in EDTA–containing tubes. Genomic DNA was isolated from peripheral blood leukocytes, was quantified by spectrophotometry and stored at -20οC until analyzed. Amplification and genotyping for the FAS rs2234767, CXCL12 rs1801157, TP53 (codon 72) rs1042522 and CYP1A1*2C rs1048943 SNPs was performed by restriction fragments lengths polymorphism (RFLPs). Concerning TP53, the Pro allele yielded a 178- bp product, while the Arg allele yielded a 136-bp PCR product. Regarding CXCL12, the G allele yielded a 193-bp and a 100-bp product, while the A allele yielded a 293-bp product and concerning CYP1A1, the A allele yielded 149-bp and 55-bp products, while the G allele yielded a 204-bp product. Finally, concerning FAS, the A allele yielded a product of 122-bp and the G allele yielded products of 103-bp and 19-bp.Data manipulations and statistical analyses were conducted using (a) the IBM SPSS Statistics Version 25 statistical package, and (b) a set of MS Excel applications developed in the laboratory of Bio‑Medical Data Analyses, Digital Applications and Interdisciplinary Approaches in Medical School of Crete. Chi‑square and Fischer's exact tests were also performed for data analysis. P values <0.05 were considered as statistically significant. The rs1048943 of CYP1A1 gene was genotyped in 84 patients (49 males, 35 females) and 125 controls, rs1801157 of CXCL12 was genotyped in 83 patients (49 males, 34 females) and 120 controls and rs1042522 of TP53 gene was genotyped in 86 patients (51 males, 35 females) and 121 controls. The rs2234767 of FAS was genotyped in 103 patients and 118 controls. CYP1A1: We observed a frequency of 51/84 (60.7%) and 105/125 (84%) for AA genotype, 33/84 (39.3%) and 19/125 (15.2%) for AG genotype and 0/84 (0%) and 1/125 (0.8%) for GG genotype among patients and controls, respectively. A significant correlation was found between the AG genotype and ALL patients (OR=3,5759; 95% CI: 1.8553-6.8918). A person with AG genotype has 3,57 times chances of being ALL patient compared with AA genotype, which is statistically significant. CXCL12: We observed a frequency of 9/83 (10.8%) and 16/120 (13.3%) for AA genotype, 50/83 (60.2%) and 55/120 (45.8%) for AG genotype and 24/83 (28.9%) and 49/120 (40.8%) for GG genotype among patients and controls, respectively.TP53: We observed a frequency of 35/86 (40.7%) and 64/121 (52.9%) of homozygous prevalent (Arg/Arg genotype), 37/86 (43%) and 47/121 (38.8%) of heterozygotes (Arg/Pro genotype) and 14/86 (16.3%) and 10/121 (8.3%) of rare homozygous (Pro/Pro genotype) among patients and controls, respectively. We noticed that a person with TP53 Pro/Pro has 2,56 times chance of being ALL patient compared with TP53 Arg/Arg (OR= 2.5600, 95% CI= 1.0303-6.3607), which is statistically significant.FAS: We observed a frequency of 2/103 (1.9%) and 58/118 (49.2%) for AA genotype, 19/103 (18.4%) and 9/118 (7.6%) for AG genotype and 82/103 (79.6%) and 51/118 (43.2%) for GG genotype among patients and controls, respectively. A significant correlation was found between AG genotype and ALL patients (OR = 61.2222, 95% CI = 12.1470 - 308.5663) and GG genotype and risk of ALL (OR = 46.6275 95% CI = 10.9122 - 199.2382). An individual with AG genotype has 20,35 times the risk of being a patient than those who carries AA genotype and an individual with GG genotype has 18,49 times the risk of being a patient than those who carries AA genotype, and these results are statistically significant.Moreover, we tested the possible combinations of CYP1A1, CXCL12 and TP53 in pairs and in all three together. FAS rs2234767 polymorphism was not included in the genotype combinations as it was analyzed at a later time. We showed that an individual with CYP1A1 AG and TP53 Arg/Pro genotype has 3,14 times the risk of being a patient with ALL compared to those who carries the wild/major type for both genes OR= 4.6184, 95% CI= 1.6584-12.8620. Moreover, an individual with CYP1A1 AG and CXCL12 GG has 8,29 times the risk of being a patient than those who carries AA genotype for both genes (OR= 11.3684, 95% CI= 2.2156-58.3335), whereas an individual with CYP1A1 AG and CXCL12 AG genotype has 1,9 times the risk of being a patient compared to the wild type (OR= 5.4000, 95% CI= 1.6899-17.2557). Finally, an individual with CYP1A1 AG, CXCL12 AG and TP53 Pro/Pro genotype has 11,2 times chances of being ALL patient compared to those who have AA genotype for CYP1A1 and CXCL12 and Arg/Arg genotype for TP53 (OR= 11.2000, 95% CI= 1.0421-120.3681), which is statistically significant.Our study is the first report that associates CYP1A1*2C heterozygotes with an increased risk for ALL in Caucasian children. To our knowledge, it is also the first study that investigated the different combinations of the polymorphisms of CYP1A1*2C (rs1048943), CXCL12 (rs1801157) and TP53 (rs1042522) genes, leading to some interesting results. The risk of developing pediatric ALL is significantly increased when an individual has the following combinations of genotypes i) CYP1A1 AG and TP53 Arg/Pro, ii) CYP1A1 AG and CXCL12 GG, iii) CYP1A1 AG and CXCL12 AG, iv) CYP1A1 AG, CXCL12 AG and TP53 Pro/Pro. In addition, our study correlated heterozygotes (AG) and homozygotes (GG) for FAS rs2234767 polymorphism with an increased risk of ALL, a result that is consistent with literature data on this polymorphism.The main limitation of our study is the small study population, which does not allow the generalization of this results' interpretation. Thus, studies with a larger number of both patients and controls are needed to support further the data presented. We consider that the investigation of the above genotypes’ combinations that increased the ALL risk in our study population may be a promising future screening tool for increased ALL risk in children.

Η οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ) είναι ο πιο συχνός τύπος λευχαιμίας στην παιδική ηλικία. Αντιπροσωπεύει το ένα τρίτο όλων των νεοπλασιών που διαγιγνώσκονται σε παιδιά κάτω των 15 ετών. Παρά τα υψηλά ποσοστά επιβίωσης-ίασης (συνολική επιβίωση άνω του 90%), ένας αξιοσημείωτος αριθμός παιδιών υποτροπιάζει, και για αυτά η έκβαση είναι δυσμενής. Επιδημιολογικές μελέτες που εξετάζουν τους πιθανούς παράγοντες κινδύνου για καρκινογένεση, έδειξαν ότι οι κληρονομούμενες γενετικές παραλλαγές μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στη λευχαιμογένεση. Πρόσφατες μελέτες συσχέτισης γονιδίων με τον κίνδυνο καρκινογένεσης έχουν επικεντρωθεί στις επιδράσεις των πολυμορφισμών (SNPs) γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση της φλεγμονής και της καταστολής του όγκου, όπως οι κυτταροκίνες, το ΤΡ53 και το κυτόχρωμα P450. Το CXCL12 είναι μια κυτταροκίνη που εκφράζεται σε διαφορετικούς όγκους και ο πολυμορφισμός της rs1801157 μπορεί να επηρεάσει τον κίνδυνο εμφάνισης ΟΛΛ στα παιδιά. Το TP53 είναι μια ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη, της οποίας ο πολυμορφισμός rs1042522 έχει μελετηθεί μεταξύ των παραγόντων κινδύνου για ανάπτυξη νεοπλασμάτων. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ των πολυμορφισμών του γονιδίου Cytochrome P450 Family 1 Subfamily A Member 1 (CYP1A1) και του κινδύνου εμφάνισης λευχαιμίας. Ειδικότερα, ο πολυμορφισμός rs1048943 του γονιδίου CYP1A1*2C έχει αναφερθεί ότι αυξάνει τον κίνδυνο ΟΛΛ στους Καυκάσιους. Το γονίδιο FAS, γνωστό και ως TNFSF6/CD95/APO-1, ανήκει στην οικογένεια των υποδοχέων παραγόντων νέκρωσης όγκων (TNF receptors) και είναι ένα από τα απαραίτητα μόρια του μονοπατιού απόπτωσης. Ο πολυμορφισμός rs2234767 του γονιδίου FAS πρόκειται για αντικατάσταση της G από Α στη θέση -1377, που έχει δειχθεί ότι μειώνει τη δραστηριότητα του υποκινητή και τα επίπεδα έκφρασης του FAS. Η μειωμένη έκφραση του FAS γονιδίου οδηγεί σε μείωση της απόπτωσης που διαμεσολαβείται από το FAS και συνεπώς σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο για νεοπλασία. Ο συγκεκριμένος πολυμορφισμός έχει δειχθεί ότι μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο για καρκινογένεση.Σε αυτή τη μελέτη, διερευνούμε τη σχέση μεταξύ γενετικών πολυμορφισμών των γονιδίων FAS, CYP1A1, CXCL12 και TP53 σε παιδιά και εφήβους ασθενείς με ΟΛΛ στην Κρήτη. Η ομάδα των ασθενών αποτελείται από 86 ασθενείς, παιδιά και εφήβους (51 άρρενες και 35 θήλεις) που διαγνώστηκαν με ΟΛΛ στην Κλινική Αιματολογίας-Ογκολογίας Παίδων του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου Κρήτης από το 1990 έως τον Ιανουάριο του 2018. Η ομάδα ελέγχου αποτελείται από 105 ενήλικες αιμοδότες και 20 παιδιά, από την ίδια γεωγραφική περιοχή. Ολικό αίμα συλλέχθηκε σε σωληνάρια που περιέχουν EDTA. Το γενωμικό DNA απομονώθηκε από τα λευκά αιμοσφαίρια περιφερικού αίματος, ποσοτικοποιήθηκε με φασματοφωτομετρία και αποθηκεύτηκε στους -200C έως ότου αναλυθεί. Η γονοτύπιση για τους πολυμορφισμούς FAS rs2234767, CXCL12 rs1801157, TP53 (κωδικόνιο 72) rs1042522 και CYP1A1 * 2C rs1048943 πραγματοποιήθηκαν με τη μέθοδο των RFLPs. Όσον αφορά το TP53, το αλληλόμορφο της Προλίνης απέδωσε προϊόν 178 ζευγών βάσεων, ενώ το αλληλόμορφο Αργινίνης απέδωσε προϊόν 136 ζευγών βάσεων. Όσον αφορά το CXCL12, το αλληλόμορφο G απέδωσε προϊόντα 193 και 100 ζευγών βάσεων, ενώ το αλληλόμορφο A απέδωσε ένα προϊόν 293 ζευγών βάσεων. Όσον αφορά το CYP1A1, το αλληλόμορφο A απέδωσε προϊόντα 149 και 55 ζευγών βάσεων, ενώ το αλληλόμορφο G απέδωσε ένα προϊόν 204 ζευγών βάσεων. Τέλος, όσον αφορά το FAS, το αλληλόμορφο Α απέδωσε προϊόν 122 ζευγών βάσεων και το αλληλόμορφο G απέδωσε προϊόντα 103 και 19 ζευγών βάσεων.Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας (α) το στατιστικό πακέτο IBM SPSS Statistics Version 25 και (β) ένα σύνολο εφαρμογών MS Excel που αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο στο εργαστήριο αναλύσεων βιο-ιατρικών δεδομένων, ψηφιακών εφαρμογών και διεπιστημονικών προσεγγίσεων της Ιατρικής σχολής Πανεπιστημίου Κρήτης. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος χ2 και το Fischer’s exact test. Οι τιμές Ρ <0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.Ο πολυμορφισμός rs1048943 του γονιδίου CYP1A1 αναλύθηκε σε 84 ασθενείς (49 άνδρες, 35 γυναίκες) και 125 μάρτυρες, ο rs1801157 του CXCL12 γονοτυπήθηκε σε 83 ασθενείς (49 άνδρες, 34 γυναίκες) και 120 μάρτυρες και ο rs1042522 του γονιδίου TP53 αναλύθηκε σε 86 ασθενείς (51 άνδρες, 35 γυναίκες) και 121 μάρτυρες. Ο πολυμορφισμός rs2234767 του FAS γονοτυπήθηκε σε 103 ασθενείς και 118 μάρτυρες. CYP1A1: Παρατηρήσαμε μια συχνότητα 51/84 (60,7%) και 105/125 (84%) για τον γονότυπο AA, 33/84 (39,3%) και 19/125 (15,2%) για τον γονότυπο AG και 0/84 (0 %) και 1/125 (0,8%) για τον γονότυπο GG σε ασθενείς και μάρτυρες, αντίστοιχα. Βρέθηκε μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ του γονότυπου AG και των ασθενών με ΟΛΛ (OR = 3,5759, 95% CI: 1,8553-6,8918). Ένα άτομο με AG γονότυπο έχει 3,57 φορές πιθανότητα να είναι ασθενής σε σύγκριση με ένα άτομο που φέρει το γονότυπο ΑΑ.CXCL12: Παρατηρήσαμε μια συχνότητα 9/83 (10,8%) και 16/120 (13,3%) για τον γονότυπο AA, 50/83 (60,2%) και 55/120 (45,8%) για τον γονότυπο AG και 24/83 (28,9 %) και 49/120 (40,8%) για τον γονότυπο GG σε ασθενείς και μάρτυρες, αντίστοιχα.TP53: Παρατηρήσαμε μια συχνότητα 35/86 (40,7%) και 64/121 (52,9%) ομόζυγου γονότυπου για το μείζον αλληλόμορφο (Aργ/Αργ), 37/86 (43%) και 47/121 (38,8%) ετεροζυγωτών (γονότυπος Αργ/Προ) και 14/86 (16,3%) και 10/121 (8,3%) του ομόζυγου γονοτύπου για το έλλασον αλληλόμορφο (Προ/Προ) μεταξύ ασθενών και μαρτύρων, αντίστοιχα. Παρατηρήσαμε ότι ένα άτομο με γονότυπο TP53 Προ/Προ έχει 2,56 φορές πιθανότητα να είναι ασθενής σε σύγκριση με ένα άτομο που φέρει το γονότυπο TP53 Αργ/Αργ (OR = 2,5600, 95% CI = 1,0303-6,3607), το οποίο είναι στατιστικά σημαντικό.FAS: Παρατηρήσαμε συχνότητα 2/103 (1,9%) και 58/118 (49,2%) για τον γονότυπο AA, 19/103 (18,4%) και 9/118 (7,6%) για τον γονότυπο AG και 82/103 (79,6%) και 51/118 (43,2%) για τον γονότυπο GG σε ασθενείς και μάρτυρες, αντίστοιχα. Βρέθηκε μια συσχέτιση μεταξύ του γονότυπου AG και των ασθενών με ΟΛΛ (OR= 61.2222, 95% CI= 12.1470 - 308.5663) καθώς και του γονοτύπου GG και των ασθενών με ΟΛΛ (OR= 46.6275, 95% CI= 10.9122 - 199.2382). Σε σχέση με εκείνα τα άτομα που έχουν το γονότυπο ΑΑ ένα άτομο με γονότυπο AG έχει 20,35 φορές τον κίνδυνο να είναι ασθενής με ΟΛΛ, ενώ ένα άτομο που φέρει το γονότυπο GG έχει 18,49 φορές τον κίνδυνο να είναι ασθενής με ΟΛΛ.Επίσης, εξετάσαμε τους πιθανούς συνδυασμούς γονοτύπων CYP1A1, CXCL12 και TP53 σε ζεύγη και συνδυασμούς των τριών μαζί. Ο πολυμορφισμός rs2234767 του FAS δεν συμπεριελήφθη στους συνδυασμούς γονοτύπων, καθώς αναλύθηκε σε μεταγενέστερο χρόνο. Δείξαμε ότι ένα άτομο με γονότυπο CYP1A1 AG και TP53 Αργ/Προ έχει 3,14 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο να είναι ασθενής με ΟΛΛ σε σύγκριση με άτομα που φέρουν τον αρχέγονο γονότυπο και για τα δύο γονίδια (OR = 4.6184, 95% CI = 1.6584- 12.8620). Επιπλέον, ένα άτομο με CYP1A1 AG και CXCL12 GG έχει 8,29 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο να είναι ασθενής από εκείνο που φέρει γονότυπο AA και για τα δύο γονίδια (OR = 11.3684, 95% CI = 2.2156-58.3335), ενώ ένα άτομο με γονότυπο CYP1A1 AG και CXCL12 AG έχει 1,9 φορές τον κίνδυνο να είναι ασθενής σε σύγκριση με τον αρχέγονο γονότυπο (OR = 5.4000, 95% CI = 1.6899-17.2557).Τέλος, ένα άτομο με γονότυπο CYP1A1 AG, CXCL12 AG και TP53 Προ/Προ έχει 11,2 φορές μεγαλύτερη πιθανότητα να είναι ασθενής σε σύγκριση με εκείνους που έχουν γονότυπο AA για τα CYP1A1 και CXCL12 και γονότυπο Αργ/Αργ για το TP53 (OR = 11.2000, 95 % CI = 1.0421-120.3681).Η μελέτη μας είναι η πρώτη, βιβλιογραφικά, που συσχετίζει τους ετεροζυγώτες CYP1A1 * 2C με αυξημένο κίνδυνο για ΟΛΛ σε παιδιά Καυκάσιας φυλής. Από όσα γνωρίζουμε, είναι επίσης η πρώτη μελέτη που διερευνά τους διαφορετικούς συνδυασμούς των πολυμορφισμών των γονιδίων CYP1A1 * 2C (rs1048943), CXCL12 (rs1801157) και TP53 (rs1042522), οδηγώντας σε μερικά ενδιαφέροντα αποτελέσματα. Ο κίνδυνος ανάπτυξης ΟΛΛ σε παιδιά-εφήβους αυξάνεται σημαντικά όταν ένα άτομο έχει τους ακόλουθους συνδυασμούς γονότυπων i) CYP1A1 AG και TP53 Aργ/Προ, ii) CYP1A1 AG και CXCL12 GG, iii) CYP1A1 AG και CXCL12 AG, iv) CYP1A1 AG, CXCL12 AG και TP53 Προ/Προ. Επιπλέον, η μελέτη μας συσχέτισε τους ετεροζυγώτες (AG) και τους ομοζυγώτες (GG) για τον πολυμορφισμό rs2234767 του FAS με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης ΟΛΛ, αποτέλεσμα που συνάδει με τα βιβλιογραφικά δεδομένα για τον εν λόγω πολυμορφισμό και την ΟΛΛ. Ο κύριος περιορισμός της μελέτης μας είναι ο μικρός αριθμός ατόμων που αναλύθηκαν, ο οποίος δεν επιτρέπει τη γενίκευση της ερμηνείας των αποτελεσμάτων. Συνεπώς, απαιτούνται μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό ασθενών και μαρτύρων για την περαιτέρω υποστήριξη των δεδομένων που παρουσιάζονται. Θεωρούμε ότι η διερεύνηση των συνδυασμών των παραπάνω γονότυπων, που αύξησαν τον κίνδυνο ΟΛΛ στο δικό μας πληθυσμό, μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο μελλοντικό εργαλείο διαλογής για τον αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης ΟΛΛ στα παιδιά.