Η μελέτη των αμετάβλητων φυσικών κυτταροκτόνων Τ-λεμφοκυττάρων (iNKT) σε ασθενείς με οστεοπόρωση

Abstract

Background: Osteoporosis is the most common bone disease and affects millions of postmenopausal women worldwide. It is a major health problem with a high cost for National Health Systems. Oestrogen loss affects the bone immune environment in a way that promotes bone resorption. Increased osteoclastogenic action leads to osteoporosis. The role of RANKL/RANK/OPG pathway in osteoporosis is well established, as is the role of Tregs in bone resorption. Invariant natural killer T cells (iNKT), a rare, but powerful subset of Tregs cells, are important cells for bone homeostasis.Our aim was to investigate a) the amount of iNKTs in peripheral human blood and how this is affected by oestrogen loss, and b) the contribution of iNKTs in the increased receptor activator of the nuclear factor-kB ligand (RANKL) pool and bone resorption, a characteristic of patients with osteoporosis. Finally, we wanted to correlate our findings with the oestrogen levels and bone density.Material/Methods: Whole blood was collected from 79 female patients, who were referred to our hospital osteoporosis clinic for diagnosis and treatment. All patients underwent Dexa scan, and the T-score was calculated, in order to classify our patients according to the World Health Organization (WHO) criteria for diagnosis and classification of osteoporosis. Patients with coexisting diseases linked to a high RANKL expression were excluded. Eleven patients had a T-score >–1.0 and were included in our normal donors (ND) group, 46 patients had a T-score between –1 and –2.5 (osteopenia group), whereas 22 patients had a T-score <–2.5 (osteoporosis group). We performed a-galactosylceramide activation of iNKT cells in vitro. Surface RANKL expression was detected with multicolor flow cytometry in naive and activated lymphocytes. Beta-Crosslaps (b-CTX) levels were measured in whole blood plasma with ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). 17β-oestradiol levels were measured with RIA (Radioimmunoassay).Results: Although iNKT cells were not clonally expanded in patients with osteoporosis, iNKT cells from osteoporotic patients overexpressed RANKL compared to ND and osteopenic patients. This is a distinctive feature of iNKT cells and is not seen in conventional T-lymphocytes. In addition, iNKT cell activation by the prototypal glycolipid ligand a-galactosylceramide increased by 8 times their RANKL expression. RANKL expression in iNKT cells was not related to b-CTX levels in the blood. We found no correlation between the levels of 17β-oestradiol and RANKL expression on iNKTs. Finally, we found a strong correlation between 17β-oestradiol levels and T score.Conclusions: In patients with osteoporosis, iNKT cells specifically overexpress RANKL, a cytokine that regulates osteoclast activity. RANKL overexpression is not related to clonal expansion of iNKTs. The rest of T cells do not overexpress RANKL. It seems that iNKT cells have a long-standing effect on the bone physiology, which plays an important role in the bone loss of patients with osteoporosis. We assume the existence of an agal-type antigen, which is hyper-expressed and turns iNKTs towards RANKL overexpression and bone resorption. This could mean that, in the future, the use of other targeted glycolipid antigens could be used to prevent this.We assume that, the weak correlation between b-CTX levels and RANKL expression on iNKTs is the effect of a probably low burden of antigenic stimulation by a still unknown glycolipid antigen.We found no quantitave correlation between oestrogens and RANKL on iNKTs, but that does not exclude some other type of correlation.The already known correlation between oestrogen levels and T score, which was confirmed in our study, suggests that our sample was reliable.

Υπόβαθρο - Σκοπός: Η οστεοπόρωση είναι η πιο κοινή νόσος των οστών και επηρεάζει εκατομμύρια μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες παγκοσμίως. Αποτελεί μείζον υγειονομικό πρόβλημα με υψηλό κόστος για τα Εθνικά Συστήματα Υγείας. Η απώλεια οιστρογόνων επηρεάζει το οστικό ανοσολογικό περιβάλλον με τρόπο, που προάγει την οστική απορρόφηση. Αυξημένη οστεοκλαστική δράση οδηγεί σε οστεοπόρωση. Ο ρόλος του άξονα RANKL/RANK/OPG στην οστεοπόρωση είναι καλά προσδιορισμένος, όπως είναι και ο ρόλος των Τ ρυθμιστικών κυττάρων στην οστική απορρόφηση. Τα αδιαφοροποίητα φυσικά κυτταροκτόνα Τ λεμφοκύτταρα (iNKT), μια σπάνια, αλλά ισχυρή υποομάδα Τ ρυθμιστικών κυττάρων, είναι σημαντικά κύτταρα για την ομοιόσταση των οστών.Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί α) η ποσότητα των iNKT στο ανθρώπινο περιφερικό αίμα, και β) η συμβολή των iNKT στην αυξημένη ποσότητα ενεργοποιητή του υποδοχέα του πυρηνικού παράγοντα-κΒ (RANKL) και της οστικής απορρόφησης, χαρακτηριστικό των ασθενών με οστεοπόρωση. Τέλος, θέλαμε να συσχετίσουμε τα αποτελέσματά μας με τα επίπεδα οιστρογόνων και την οστική πυκνότητα.Υλικό – Μέθοδοι: Συλλέχθηκε ολικό αίμα από 79 γυναίκες ασθενείς, οι οποίες είχαν παραπεμφθεί στην κλινική οστεοπόρωσης του νοσοκομείου μας για διάγνωση και θεραπεία. Όλες οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε απορροφησιομετρία διπλής ενεργειακής δέσμης ακτινών-Χ και το Τ-σκορ υπολογίστηκε με σκοπό να κατηγοριοποιηθούν οι ασθενείς σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκοσμίου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ) για τη διάγνωση και ταξινόμηση της οστεοπόρωσης. Ασθενείς με συνυπάρχουσες παθήσεις, που συνδέονται με μια υψηλή έκφραση του RANKL, αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Έντεκα ασθενείς είχαν Τ σκορ >-1.0 και συμπεριλήφθηκαν στους Φυσιολογικούς Δότες (ΦΔ), 46 ασθενείς είχαν σκορ μεταξύ -1.0 και -2.5 (ομάδα οστεοπενίας), ενώ 22 ασθενείς είχαν Τ σκορ <-2.5 (ομάδα οστεοπόρωσης). Ενεργοποιήσαμε τα iNKT στο εργαστήριο με α-γαλακτοσυλική κεραμίδη. Η έκφραση του επιφανειακού RANKL ανιχνεύθηκε με πολυχρωματική κυτταρομετρία ροής σε άωρα και ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα. Τα επίπεδα του b-CTX (βήτα Καρβοξυ-Τελικό Διασυνδεδεμένο Τελοπεπτίδιο) μετρήθηκαν στο πλάσμα ολικού αίματος με τεχνική ELISA. Τα επίπεδα 17β-οιστραδιόλης μετρήθηκαν με τη μέθοδο RIA.Αποτελέσματα: Παρόλο που τα iNKT λεμφοκύτταρα δεν πολλαπλασιάστηκαν σε ασθενείς με οστεοπόρωση, υπερεξέφρασαν το RANKL σε σχέση με τους φυσιολογικούς και οστεοπενικούς δότες. Αυτό είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό των iNKT, που δε συναντάται σε συμβατικά Τ λεμφοκύτταρα. Επιπλέον, η ενεργοποίηση των iNKT από το πρωτότυπο γλυκολιπιδικό συνδέτη α-γαλακτοσυλική κεραμίδη αύξησε κατά 8 φορές την έκφραση του RANKL τους. Η έκφραση του RANKL στα iNKT λεμφοκύτταρα δε συσχετίστηκε με τα επίπεδα b-CTX στο αίμα. Δε βρήκαμε καμία συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων 17β-οιστραδιόλης και έκφρασης RANKL στα iNKT. Τέλος, βρήκαμε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της 17β-οιστραδιόλης και του Τ σκορ.Συμπεράσματα: Σε ασθενείς με οστεοπόρωση, τα iNKT ειδικά, υπερεκφράζουν RANKL, μια κυτταροκίνη, η οποία ρυθμίζει την οστεοκλαστική δράση. Η υπερέκφραση του RANKL δε συσχετίζεται με αύξηση των iNKT. Τα υπόλοιπα Τ κύτταρα δεν υπερεκφράζουν RANKL. Φαίνεται, πως τα iNKT λεμφοκύτταρα έχουν μια μακροπρόθεσμη επίδραση στη φυσιολογία των οστών, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην απώλεια οστού στους ασθενείς με οστεοπόρωση. Εικάζουμε την ύπαρξη ενός τύπου-agal αντιγόνου, το οποίο υπερεκφράζεται και στρέφει τα iNKT προς την υπερέκφραση RANKL και την οστική απορρόφηση. Αυτό θα μπορούσε να σημαίνει, ότι στο μέλλον, η χρήση ενός άλλου στοχευμένου αντιγόνου, θα μπορούσε να αποτρέψει αυτήν την εξέλιξη.Υποθέτουμε, ότι η αδύναμη συσχέτιση μεταξύ επιπέδων b-CTX και έκφρασης RANKL στα iNKT είναι το αποτέλεσμα ενός χαμηλού φορτίου αντιγονικής διέγερσης από ένα άγνωστο προς το παρόν γλυκολιπιδικό αντιγόνο.Δε βρήκαμε καμία ποσοτική συσχέτιση μεταξύ οιστρογόνων και RANKL στα iNKT, αλλά αυτό δεν αποκλείει κάποιου άλλου είδους συσχέτιση.Η ήδη γνωστή συσχέτιση μεταξύ οιστρογόνων και Τ σκορ, η οποία επιβεβαιώθηκε στη μελέτη μας, πιστοποιεί την αξιοπιστία του δείγματός μας.