Metal-regulated transcription: zeocin affects copper/iron-regulated transcription and causes metabolic reprogramming in saccharomyces cerevisiae

Abstract

Cellular copper homeostasis is a fundamental and continuous process in all living organisms including S. cerevisiae. However, when uptake exceeds the buffering capacity of the cell, copper becomes toxic. Thus, yeast cell has developed several mechanisms to control copper homeostasis. A major regulator is the transcription factor Mac1 (“Metal-binding activator”), which has a crucial role in sensing changes in copper ion concentrations and activating the transcription of genes involved in copper uptake in ion-depleted cells. Initial experiments of our group revealed an unexpected connection between DNA damage and copper homeostasis. Particularly, using the drug Zeocin to induce DNA damage proved that the function and specifically the DNA binding ability of the Mac1 transcription factor is hindered. Zeocin is a radiomimetic drug and apart from DNA damaging agent, is used as an antitumor drug and as an antibiotic, due to its wide range of toxicity. The rationale was to investigate which are the prerequisites of Mac1 DNA binding and identify which of them are perturbed in the presence of Zeocin. Three hypotheses had arisen which are going to be investigated and discussed in the following chapters.Chapter 2 of this thesis identifies a connection between copper homeostasis and the TORC1 protein complex in Saccharomyces cerevisiae. The connecting ring of this association is the Ksp1 kinase. Particularly, Ksp1 is a downstream regulator of TORC1 and phosphorylates the transcription factor Mac1. We found that Zeocin perturbs the Ksp1-regulated phosphorylation of Mac1 and leads to the deregulation of copper homeostasis. Analysis of the S. cerevisiae transcriptome in the presence of Zeocin, compared to other DNA damaging conditions, proved that the deregulation of copper homeostasis does not correlate with the DNA damage response, but it is a Zeocin-specific effect. According to the Zeocin-specific transcriptome, Mac1 target genes are the most down-regulated. Additionally, a negative effect on the conserved signaling pathway TORC1 was uncovered, while the TORC1 downstream pathways such as ribosome biogenesis and autophagy were found affected. Furthermore, an up-regulation of mitochondrial function was revealed. We verified the transcriptomic results by a series of functional experiments and assumed that Zeocin induces metabolic reprogramming in S. cerevisiae, through the TORC1 protein complex function.In conclusion, our results establish a functional link between the copper‐dependent Mac1‐regulated transcription and the TORC1 signaling pathway. Moreover, they have indicated two new effects of the drug Zeocin apart from its role in the DNA damage induction. First, Zeocin disturbs copper/iron‐regulated homeostasis by inhibiting the DNA binding of the Mac1 transcription factor. Second, Zeocin induces metabolic reprogramming in the S. cerevisiae, through the TORC1 protein complex function, an observation with potentially promising biomedical applications. In Chapter 3 of the thesis, we investigated the hypothesis that Mac1’s malfunction in Zeocin conditions could be due to a Mac1-Sod1 dissociation. Our results indicate that the Zeocin effect on Mac1 function is not via Sod1 protein, although, we provide evidence that the copper- and zinc-dependent enzyme Sod1 plays an important role in Mac1 transcriptional activity, in nutrient-rich conditions. Cu/Zn superoxide dismutase Sod1 is a multipotent cytoplasmic and mitochondrial enzyme, whose main known function is to detoxify the cell from superoxide ions. Furthermore, it has been reported that Sod1 enters the nucleus and affects the transcription of several genes, some of which are involved in copper homeostasis under Cu-depleted conditions and only under specific oxidative stress conditions. We found that Sod1 physically interacts with Mac1 in nutrient-rich conditions. Our results indicate that Sod1 is important for both transactivation and binding activity of Mac1 on its target promoter regions. On the other hand, a constitutively active mutant of Mac1 is not affected functionally by the ablation of Sod1. Combining our findings, we suggest that Sod1 interaction with Mac1 is vital for Mac1 functionality, due to a conformational alteration of the transcription factor. Sod1 enzymatic activity may contribute to the maintenance of a reduced cellular environment and prevents the oxidation and subsequent inactivation of the transcription factor Mac1.Chapter 4 of this thesis aimed to explore the hypothesis of direct interaction between the Mac1 transcription factor and the drug Zeocin. Having evidence that Zeocin may inhibit the function of other copper-fist containing transcription factors, we present our progress in purifying peptide derivatives of the Mac1 protein to investigate the potential direct protein-drug interaction using an acoustic biosensor.

Η ομοιόσταση του χαλκού στα κύτταρα είναι μια θεμελιώδης και συνεχής διαδικασία σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένου του ζυμομύκητα S. cerevisiae. Ωστόσο, όταν η πρόσληψη υπερβαίνει την ικανότητα απομόνωσής του από το κύτταρο, ο χαλκός γίνεται τοξικός. Έτσι, ο ζυμομύκητας έχει αναπτύξει διάφορους μηχανισμούς για τον έλεγχο της ομοιόστασης του χαλκού. Ένας σημαντικός ρυθμιστής είναι ο μεταγραφικός παράγοντας Mac1 ("Metal-binding Activator"), ο οποίος έχει τον κρίσιμο ρόλο ανίχνευσης μεταβολών στη συγκέντρωση ιόντων χαλκού και την ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων που εμπλέκονται στην πρόσληψη του χαλκού από το κύτταρο. Τα αρχικά πειράματα της ομάδας μας αποκάλυψαν μια απροσδόκητη διασύνδεση μεταξύ της επαγόμενης βλάβης στο DNA και της ομοιόστασης του χαλκού. Συγκεκριμένα, με την χρήση του φαρμάκου Zeocin για την πρόκληση βλαβών στο DNA αποδείξαμε ότι η λειτουργία και πιο συγκεκριμένα η ικανότητα πρόσδεσης του Mac1 στο DNA, παρεμποδίζεται. Η Zeocin είναι ένα ραδιομιμητικό φάρμακο το οποίο πέρα από επαγωγή βλαβών στο DNA, χρησιμοποιείται επιπλέον ως αντικαρκινικό φάρμακο και ως αντιβιοτικό, λόγω του ευρέος φάσματος τοξικότητας. Το σκεπτικό ήταν να διερευνηθούν οι προϋποθέσεις πρόσδεσης του Mac1 στους υποκινητές των γονιδίων στόχων και να προσδιοριστεί ποιες από αυτές διαταράσσονται παρουσία Zeocin. Προέκυψαν τρεις υποθέσεις οι οποίες θα ελεγχθούν και θα συζητηθούν στα επόμενα κεφάλαια.Στο κεφάλαιο 2 της διατριβής, αναλύεται η διασύνδεση της ομοιόστασης του χαλκού με το πολυ-πρωτεϊνικό σύμπλοκο TORC1 στον S. cerevisiae. Ο συνδετικός κρίκος αυτής της συσχέτισης είναι η κινάση Ksp1. Συγκεκριμένα, η Ksp1 είναι ένας κατάντη ρυθμιστής του TORC1 και επιπλέον φωσφορυλιώνει τον μεταγραφικό παράγοντα Mac1. Διαπιστώσαμε ότι η Zeocin διαταράσσει την Ksp1-ρυθμιζόμενη φωσφορυλίωση του Mac1 οδηγώντας στην απορρύθμιση της ομοιόστασης του χαλκού. Επιπλέον, η ανάλυση του μεταγραφώματος του S. cerevisiae παρουσία Zeocin, σε σύγκριση με άλλες συνθήκες επαγωγής βλαβών στο DNA, έδειξε ότι η απορρύθμιση της ομοιόστασης χαλκού δεν συσχετίζεται με την γενική απόκριση του κυττάρου σε βλάβες του DNA, αλλά παρατηρείται αποκλειστικά στη Zeocin. Παρατηρήθηκε επίδραση σε σηματοδοτικά μονοπάτια του TORC1 όπως στην βιογένεση ριβοσωμάτων και στην αυτοφαγία. Επιπλέον, αποκαλύφθηκε επαγωγή της μιτοχονδριακής λειτουργίας. Επαληθεύοντας τα αποτελέσματα του μεταγραφώματος με μια σειρά λειτουργικών πειραμάτων, συμπεραίνεται ότι η Zeocin προκαλεί μεταβολικό αναπρογραμματισμό στον S. cerevisiae, μέσω της απορρύθμισης της λειτουργίας του TORC1.Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας ισχυρίζονται μια λειτουργική διασύνδεση μεταξύ της χαλκο-εξαρτώμενης, Mac1-ρυθμιζόμενης μεταγραφής και του σηματοδοτικού μονοπατιού TORC1. Δείξαμε δύο νέες επιδράσεις του φαρμάκου Zeocin, πέρα την επαγωγή βλαβών στο DNA. Πρώτον, η Zeocin διαταράσσει την ομοιόσταση χαλκού/σιδήρου παρεμποδίζοντας τη δέσμευση του μεταγραφικού παράγοντα Mac1 στο DNA. Δεύτερον, η Zeocin προκαλεί μεταβολικό αναπρογραμματισμό στο S. cerevisiae, μέσω της λειτουργίας του πρωτεϊνικού συμπλέγματος TORC1, ένα εύρημα με δυνητική βιοϊατρική εφαρμογή.Στο κεφάλαιο 3 της διατριβής, διερευνούμε την υπόθεση εάν η δυσλειτουργία του Mac1 παρουσία Zeocin οφείλεται στην απορρύθμιση της λειτουργικής σχέσης με την πρωτεΐνη Sod1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επίδραση της Zeocin στη λειτουργία του Mac1 δεν είναι μέσω της Sod1, παρόλα αυτά, παρέχουμε στοιχεία ότι η Sod1 παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγραφική δραστηριότητα του Mac1, σε πλούσιες θρεπτικές συνθήκες. Η Cu/Zn δισμουτάση του υπεροξειδίου Sod1 είναι ένα πολυδύναμο κυτταροπλασματικό και μιτοχονδριακό ένζυμο, του οποίου η κύρια λειτουργία είναι η αποτοξίνωση του κυττάρου από ρίζες οξυγόνου. Επιπλέον, μελέτες αναφέρουν ότι η Sod1 εισέρχεται στον πυρήνα επηρεάζοντας τη μεταγραφή αρκετών γονιδίων, ορισμένα από τα οποία εμπλέκονται στην ομοιόσταση χαλκού, είτε σε συνθήκες επαγόμενης έλλειψης χαλκού, είτε σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Διαπιστώσαμε ότι η Sod1 αλληλεπιδρά με τον Mac1 σε συνθήκες πλούσιες σε θρεπτικά συστατικά. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η Sod1 είναι σημαντική για τον Mac1 τόσο για την ενεργοποίηση της μεταγραφής όσο και για τη πρόσδεση στους υποκινητές των γονιδίων-στόχων του. Από την άλλη πλευρά, ένα μετάλλαγμα του Mac1 που του επιτρέπει να είναι συνεχώς μεταγραφικά ενεργός, δεν επηρεάζεται λειτουργικά απουσία του ενζύμου Sod1. Συνδυάζοντας τα ευρήματά μας, προτείνουμε ότι η αλληλεπίδραση της Sod1 με τον Mac1 είναι σημαντική για τη λειτουργικότητα του Mac1, λόγω της διαμόρφωσης της δομής του μεταγραφικού παράγοντα. Η ενζυμική δραστηριότητα της Sod1 μπορεί να συμβάλει στη διατήρηση του αναγωγικού κυτταρικού περιβάλλοντος και να αποτρέπει την οξείδωση η οποία συνεπάγεται την αδρανοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Mac1. Στο κεφάλαιο 4 αυτής της διατριβής, σκοπεύαμε να διερευνήσουμε την υπόθεση της άμεσης αλληλεπίδρασης μεταξύ του μεταγραφικού παράγοντα Mac1 και του φαρμάκου Zeocin. Έχοντας ενδείξεις ότι η Zeocin μπορεί να αναστέλλει τη λειτουργία άλλων μεταγραφικών παραγόντων που περιέχουν την διαμόρφωση Cu-fist, προχωρήσαμε στον καθαρισμό της πρωτεΐνης Mac1 καθώς και τμημάτων της πρωτεΐνης προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή άμεση αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-φαρμάκου χρησιμοποιώντας ακουστικό βιοαισθητήρα.