Ο ρόλος του μονοπατιού Notch και των bHLH-Orange πρωτεϊνών στην αυτο-ανανέωση των νευροβλαστών στα μετεμβρυικά στάδια της D.melanogaster

Abstract

During my thesis, I studied the role of bHLH-Orange (bHLH-O) proteins and Notch pathway in the self-renewal of post embryonic neuroblasts (NBs) in D. melanogaster. bHLH-O proteins are a subfamily of the basic-helix-loop-helix transcription factors characterized by an ‘Orange’ protein-protein interaction domain. These proteins act as repressors of transcription and typical members are the Hairy/E(spl), or Hes, proteins. They usually serve as targets of Notch signalling and they are well studied in their ability, among others, to suppress neuronal differentiation in both invertebrates and vertebrates. Drosophila larval neurogenesis is an excellent system for studying the balance between self-renewal and differentiation of a somatic stem cell (neuroblast). Post-embryonic neuroblasts (NBs) are neural stem cells that remain in quiescence after embryogenesis and, upon nutrition signals early in larval life, they resume asymmetric divisions. NBs generate differentiated neurons and glia from intermediate precursors cells named GMCs or INPs. We showed that in the larval Central Nervous System (CNS), E(spl)mγ, E(spl)mβ, E(spl)m8 and Deadpan (Dpn) are all expressed both in Type I and Type II NBs, in INPs but not in differentiated cells. A double mutation for the E(spl) complex and dpn severely affected the ability of NBs to self-renew, causing premature termination of proliferation. We also discovered that expression of E(spl)mγ and m8, but not of dpn, depends on Notch signalling coming from the GMC/INP daughter to the NB. When Notch is overactivated in NB progeny cells, overproliferation defects become apparent. We found that this depends on the abnormal induction of E(spl) genes and E(spl) overexpression can partly mimic the Notch-induced overproliferation phenotype. Therefore, we discovered that E(spl) and Dpn act together to maintain the NB in a self-renewing state, a process in which they are assisted by Notch, which sustains expression of the E(spl) subset.We then used a genome-wide approach to seek the full complement of Notch target genes that affect NB self renewal. We performed transcriptomic analysis on larval CNS where Notch was overactivated for 24 hours leading to hyperplasia of NBs. We identified 1289 gene probesets whose transcript levels were upregulated. To further discern direct Notch targets from this list, we performed Chromatin immunoprecipitation to search for sequences bound by the Nicd/Su(H) complex. These sequences were isolated and hybridized to Drosophila tiling genomic arrays. As a result 169 genes were found to be direct targets of Notch. Among these genes were many transcription factors and factors involved in asymmetric cell division. We selected 10 genes from the first category and 2 from the second for further studies. We found that 5 out of 12 genes [E(spl)mγ, dpn, grh, wor, Mira, numb] were downregulated upon loss of Notch signalling whereas 9 out of 12 [E(spl)mγ, grh, wor, Mira, numb, svp, hth and antp] were upregulated when Notch was over-activated. Finally, besides the E(spl) genes, we found that two more genes ,lola and svp, were necessary for causing the pathological Notch induced hyperplasia. Svp, a gene that codes for an orphan nuclear receptor (homologous to the COUP-TF in mammals) was also sufficient for causing hyperplasia. Four more genes (cas, dpn, grh and hth) were found to play a more minor role in the Notch induced hyperplasia.

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε εκτενώς ο ρόλος των πρωτεïνών bHLH-Orange (bHLH-O) και του μονοπατιού Notch στην αυτο-ανανέωση των μετεμβρυικών νευροβλαστών της D.melanogaster. Οι πρωτεΐνες bHLH-O είναι μια υποκατηγορία των μεταγραφικών παραγόντων basic-helix-loop-helix που χαρακτηρίζεται από το μοτίβο ‘Orange’ για αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεïνών. Οι πρωτεΐνες αυτές δρούν ως καταστολείς της μεταγραφής και χαρακτηριστικά μέλη της οικογένειας είναι οι πρωτεΐνες Hairy/E(spl), ή Hes. Συνήθως αποτελούν στόχους της σηματοδότησης Notch και είναι γνωστοί για την ικανότητά τους μεταξύ άλλων να καταστέλλουν τη νευρική διαφοροποίηση σε σπονδυλωτά και ασπόνδυλα. Η νευρογένεση της προνύμφης στη Δροσόφιλα είναι ένα πολύ καλό μοντέλο για τη μελέτη της ισορροπίας ανάμεσα στην αυτοανανέωση και τη διαφοροποίηση ενός σωματικού βλαστικού κυττάρου (νευροβλάστη). Οι μετεμβρυικοί νευροβλάστες (NBs) είναι νευρικά βλαστικά κύτταρα που παραμένουν σε φάση ηρεμίας μετά το πέρας της εμβρυογένεσης και έπειτα από τη λήψη κατάλληλων θρεπτικών σημάτων στα πρώτα στάδια της προνύμφης, αρχίζουν εκ νέου να πραγματοποιούν ασύμμετρες διαιρέσεις. Οι νευροβλάστες παράγουν διαφοροποιημένους νευρώνες και γλοιακά κύτταρα από ενδιάμεσα πρόδρομα κύτταρα που ονομάζονται GMCs ή INPs. Αρχικά δείξαμε ότι οι bHLH-O πρωτεΐνες E(spl)mγ, E(spl)mβ, E(spl)m8 και Deadpan (Dpn) εκφράζονται στους νευροβλάστες και όχι στα διαφοροποιημένα κύτταρα στο ΚΝΣ της προνύμφης. Μωσαïκές γενεαλογίες οι οποίες είναι διπλά μεταλλαγμένες για τον γενετικό τόπο των γονιδίων E(spl) και για το γονίδιο dpn παρουσιάζουν δραματική μείωση στην ικανότητα αυτοανανέωσης των νευροβλαστών τους με αποτέλεσμα την πρόωρη διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων. Επιπλέον, η έκφραση των γονιδίων E(spl)mγ και m8, αλλά όχι του γονιδίου dpn, ρυθμίζεται από τη σηματοδότηση Notch που αποστέλλεται από το θυγατρικό κύτταρο GMC/INP προς τον θυγατρικό NB. Τέλος, είναι γνωστό ότι η υπερενεργοποίηση του μονοπατιού Notch στους νευροβλάστες οδηγεί στην δημιουργία υπερπλασιών. Βρήκαμε ότι αυτός ο φαινότυπος της υπερπλασίας οφείλεται στην εκτοπική επαγωγή των γονιδίων E(spl) και μάλιστα η υπερέκφραση των γονιδίων E(spl) μπορεί να μιμηθεί μερικώς αυτόν τον φαινότυπο της επαγόμενης από το Notch υπερπλασίας. Επομένως, από τα παραπάνω πειράματα βρέθηκε ότι οι πρωτεΐνες E(spl) και Dpn δρούν συνεργατικά για τη διατήρηση των νευροβλαστών στην κατάσταση της αυτοανανέωσης και σε αυτή τη διαδικασία συνδράμει το μονοπάτι Notch το οποίο επάγει την έκφραση μονάχα των γονιδίων E(spl).Εν συνεχεία καταφύγαμε σε μια γονιδιωματική ανάλυση για να αναγνωρίσουμε το σύνολο των στόχων του μονοπατιού Notch που επηρεάζουν την ικανότητα αυτοανανέωσης στους μετεμβρυικούς νευροβλάστες. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση του συνολικού μεταγραφώματος (μικροσυστοιχίες Affymetrix) σε προνυμφικά ΚΝΣ όπου ο υποδοχέας Notch είναι υπερενεργός για 24 ώρες και προκαλεί υπερπλασία των νευροβλαστών. Από αυτές τις μικροσυστοιχίες 1289 ιχνηθέτες γονιδίων σημείωσαν αύξηση στα επίπεδα έκφρασής τους. Για την εύρεση των άμεσων στόχων της σηματοδότησης Notch, προχωρήσαμε σε ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (Ch-IP) με σκοπό την αναγνώριση θέσεων που καταλαμβάνει το συμπλόκο Nicd/Su(H) στο γονιδίωμα στο ΚΝΣ προνυμφών με υπερενεργοποίηση του μονοπατιού Notch για 24 ώρες. Οι αλληλουχίες στις οποίες προσδέθηκε το σύμπλοκο αυτό υβριδοποιήθηκαν σε μικροσυστοιχίες που φέρουν ολιγονουκλεοτίδια που καλύπτουν το σύνολο του γονιδιώματος της Δροσόφιλας (tiling arrays). Προέκυψαν 169 γονίδια ως άμεσοι στόχοι του Notch. Μεταξύ αυτών υπήρχαν πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες και παράγοντες που εμπλέκονται στο μηχανισμό της ασύμμετρης διαίρεσης. Επιλέξαμε 10 απο την πρώτη κατηγορία [τα γονίδια E(splmγ και dpn που μελετήθηκαν σε βάθος στο πρώτο μέρος της διατριβής και τα γονίδια, svp, cas, grh, wor, Antp, hth, lola, seq ] και 2 από τη δεύτερη (Mira και numb) για περαιτέρω μελέτη. Βρήκαμε ότι 5 από τα 12 γονίδια [E(spl)mγ, grh, wor, Mira, numb) αποκρίνονται σε απώλεια της λειτουργίας του Notch σε ποικίλο βαθμό ενώ 10 από τα 12 εμφανίζουν συσσώρευση μετά την υπερενεργοποίηση του Notch [E(spl)mγ, dpn, grh, wor, Mira, numb, svp, cas, hth και Antp]. Τέλος, πέρα από τα γονίδια E(spl), βρέθηκε ότι τα γονίδια lola και svp ήταν αναγκαία για την παθολογική Notch επαγόμενη υπερπλασία. Το γονίδιο svp που κωδικοποιεί έναν ορφανό πυρηνικό υποδοχέα στεροειδών (ομόλογο του COUP-TF στα θηλαστικά) ήταν ακόμα επαρκές για την επαγωγή υπερπλασιών στους νευροβλάστες. Τέσσερα ακόμα γονίδια (cas, dpn, grh και hth) βρέθηκαν να διαδραματίζουν ένα μικρότερο ρόλο σε αυτές τις υπερπλασίες.