Integrated computational and experimental methods for the characterization of the frequency and functional consequences of RNA editing in microRNAs

Abstract

The discovery of microRNAs (miRNAs) in the early 1990s, gave birth to a reactive new biomedical field, that of non-coding RNA (ncRNA) research. The emergence of functional ncRNA interactions with coding RNA (messenger RNA, mRNA) as well as with other ncRNAs revealed the importance of cataloguing the RNA interactome. Biotechnological leaps enabled the development of numerous distinctive high-throughput sequencing protocols, which yield immense amounts of biological data in each run. The translation of biological Big Data into meaningful information depends entirely on state-of-the-art algorithms and in silico methodologies. Bioinformatics analysis constitutes now the main workhorse for the large-scale characterization and comparison of coding and non-coding RNA abundance and interactions, in physiological and pathological states alike. Large-scale integration of Next Generation Sequencing (NGS) datasets offers the potential to develop models that accurately depict or capture ncRNA biogenesis and functions, as well as modifications these molecules are naturally subjected to, effectively boosting basic biological research and translational endeavors such as the identification of therapeutic targets and diagnostic biomarkers. This dissertation focuses on the most actively studied ncRNA class, miRNAs. They are short RNA molecules (~22 nucleotides long) which exert their post-transcriptional regulatory function by targeting miRNA Recognition Elements (MREs) on the sequence of coding and non-coding RNAs (e.g. long non-coding RNAs, lncRNAs). miRNA-MRE binding follows complex rules of perfect or imperfect RNA complementarity and results in translational suppression and/or degradation of the targeted transcript(s). The vast majority of biological processes in higher mammals are under miRNA regulation.RNA editing is a type of post-transcriptional modification that is catalyzed by specialized enzymes and occurs in specific miRNAs under physiological conditions. Since miRNA targeting is highly sequence-specific, the targeting repertoire of a miRNA can be affected substantially due to editing. NGS experiments enable the exploration of RNA editing in all transcribed molecules, however it’s a challenging task; mismatches on the reference RNA sequence could also be exhibited due to the presence of DNA variation on the corresponding genomic locus, or they could be sequencing errors. During the course of this PhD thesis, a miRNA editing identification algorithm was developed. This algorithm combines small RNA Sequencing (sRNA-Seq) experimental datasets with variant information retrieved from reference resources or from matching Whole Genome Sequencing (WGS) datasets from the same individual, tissue or state, in order to filter out putative false positive RNA editing calls. Our algorithm was applied in datasets derived from numerous healthy/cancerous tissues and cell-lines and the most prominent editing events were catalogued. A downstream analysis of the effects of RNA editing in the targeting repertoire of edited miRNAs was conducted, by deploying state-of-the-art miRNA target prediction methods. Evolutionary conservation and thermodynamic stability characteristics of the observed edited and unedited miRNA forms were also studied. During my doctoral dissertation, I participated in 7 published studies in high impact-factor journals (i.e. one presentation of a small RNA quantification application, three studies related to miRNA targeting, the showcase of a database of experimentally supported microbe-disease associations and two transcriptomic analyses of the efficacy of novel vaccines against leishmaniasis), as well as in the co-authoring of a book chapter describing computational methods in miRNA research. I presented research findings in 7 scientific conferences (4 national and 3 international), and have contributed to the organization of the European Conference of Computational Biology (ECCB’18) and the 5th Postgraduate and Postdoctoral Researchers’ Meeting of the Hellenic Pasteur Institute (2019). My total publications have been cited 356 times, according to Google Scholar.On 7/12/2016, the State Scholarship Foundation (I.K.Y.) accepted to fund my proposal on the computational and experimental study of RNA editing in microRNAs, in the form of a 36-month scholarship.

Η ανακάλυψη των μικρών RNAs (microRNAs, miRNAs) τη δεκαετία του 1990 και άλλων κλάσεων μη-κωδικοποιών RNAs (non-coding RNAs, ncRNAs), δημιούργησε ένα πεδίο εντατικής έρευνας. Στο χώρο αυτό αναδείχτηκε η σημασία της μελέτης των αλληλεπιδράσεων των ncRNAs, τόσο μεταξύ τους όσο και με κωδικοποιά μετάγραφα (messenger RNAs, mRNAs). Η βιοπληροφορική ανάλυση αποτελεί κύριο μέσο για τη χαρτογράφηση και σύγκριση της αφθονίας των κωδικοποιών και μη-κωδικοποιών RNAs και των αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους, τόσο σε παθολογικές όσο και σε φυσιολογικές καταστάσεις. Η πρόοδος της βιοτεχνολογίας επέτρεψε την ανάπτυξη πληθώρας πειραμάτων αλληλούχησης υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας (high-throughput experiments), τα οποία αποφέρουν τεράστιο όγκο βιολογικών δεδομένων. Η ανάλυση και αξιοποίηση των δεδομένων αυτών βασίζεται εξ' ολοκλήρου σε αλγορίθμους και υπολογιστικές μεθοδολογίες αιχμής. Η αξιοποίηση και ενσωμάτωση (integration) συνόλων δεδομένων από πειράματα Αλληλούχησης Επόμενης Γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS) επιτρέπει την ανάπτυξη μεθόδων/μοντέλων που αναπαριστούν ή καταγράφουν με πιστότητα τη βιογένεση, το μηχανισμό δράσης, καθώς και τις τροποποιήσεις των ncRNAs και επιτρέπουν τη μελέτη βιολογικών μηχανισμών, την ανάδειξη θεραπευτικών στόχων και διαγνωστικών βιοδεικτών. Η παρούσα διατριβή επικεντρώνεται στην πιο εντατικά μελετούμενη κατηγορία ncRNAs, τα miRNAs. Πρόκειται για RNAs μήκους περίπου 22 νουκλεοτιδίων που δρουν ως ισχυροί μετα-μεταγραφικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης, στοχεύοντας κωδικοποιά (mRNA) και μακρά μη-κωδικοποιά (π.χ. long non-coding RNA, lncRNA) μετάγραφα σε μικρές ακολουθίες τους που αποκαλούνται Στοιχεία Αναγνώρισης από miRNAs (miRNA Recognition Elements, MREs). Κατά τη στόχευση, τα miRNAs προσδένονται στα MREs με βάση σύνθετους κανόνες τέλειας ή ατελούς συμπληρωματικότητας του RNA, επάγοντας την καταστολή της μετάφρασης και/ή την αποικοδόμησή του. Η πλειοψηφία των βιολογικών διεργασιών στα ανώτερα θηλαστικά ρυθμίζεται από τη δράση των miRNAs.Η μετα-μεταγραφική τροποποίηση (RNA editing) των miRNAs από εξειδικευμένα ένζυμα αποτελεί μια φυσιολογική βιολογική διεργασία που μεταβάλλει το ρεπερτόριο στόχευσής τους. Η μεταβολή αυτή δύναται να είναι ήπια ή δραστική, ανάλογα με τη θέση στην οποία λαμβάνει χώρα η τροποποίηση. Τα πειράματα NGS επιτρέπουν την ταυτόχρονη μελέτη του RNA editing σε όλα τα μεταγραφθέντα RNAs, όμως η αναγνώριση συμβάντων τροποποίησης μέσα από αυτά αποτελεί πρόκληση· οι παρατηρούμενες αλλαγές στη γνωστή ακολουθία των RNAs ενδέχεται εναλλακτικά να οφείλονται στην παρουσία μεταλλαγών στο επίπεδο του DNA ή σε σφάλματα κατά την αλληλούχηση.Κατά τη διατριβή αυτή σχεδιάστηκε αλγόριθμος ταυτοποίησης περιστατικών RNA editing στα miRNAs, ο οποίος συνδυάζει σύνολα δεδομένων Αλληλούχησης των Μικρών RNAs (small RNA Sequencing) με πληροφορίες για την παρουσία μεταλλαγών, προερχόμενες από Βάσεις Δεδομένων αναφοράς ή πειράματα Αλληλούχησης του Γονιδιώματος (Whole Genome Sequencing) του ίδιου ατόμου, ιστού, ή της ίδιας πειραματικής συνθήκης. Ο αλγόριθμος αξιοποιήθηκε για την ταυτοποίηση συμβάντων RNA τροποποίησης στην ακολουθία των miRNAs σε υγιείς/καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές. Πέραν της καταγραφής των πιο επιφανών περιπτώσεων τροποποίησης, τα miRNAs που βρέθηκαν τροποποιημένα υποβλήθηκαν σε ανάλυση για να αναδειχθεί η μεταβολή στο ρεπερτόριο στόχευσής τους, χρησιμοποιώντας αλγορίθμους αιχμής για την εύρεση των στόχων τους. Επίσης, μελετήθηκαν συγκριτικά χαρακτηριστικά της εξελικτικής συντήρησης και της θερμοδυναμικής ευστάθειας των ακολουθιών των miRNAs στα οποία παρατηρούνται φαινόμενα RNA τροποποίησης. Κατά την εκπόνηση του διδακτορικού μου, συμμετείχα σε 7 δημοσιευμένες εργασίες σε επιστημονικά περιοδικά υψηλού κύρους (μία παρουσίαση εργαλείου ποσοτικοποίησης των μικρών RNAs, τρεις εργασίες σχετικές με τη μελέτη της στόχευσης mRNAs/lncRNAs από miRNAs, μία παρουσίαση Βάσης Δεδομένων με συσχετίσεις της αφθονίας μικροβίων με ασθένειες και δύο μεταγραφωματικές μελέτες δράσης εμβολίων ενάντια στη λεϊσμάνια), καθώς και στη συγγραφή ενός κεφαλαίου βιβλίου αναφορικά με τις υπολογιστικές μεθόδους μελέτης των miRNAs. Έχω παρουσιάσει ερευνητικά ευρήματα συνολικά σε 7 επιστημονικά συνέδρια-ημερίδες (4 εθνικά, 3 διεθνή), και έχω συμβάλει στη διοργάνωση του Πανευρωπαϊκού Συνεδρίου Βιοπληροφορικής ECCB’18 και της 5ης Ημερίδας Μεταπτυχιακών και Μεταδιδακτόρων του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, το 2019. Σύμφωνα με το Google Scholar οι εργασίες στις οποίες μετέχω έχουν μέχρι στιγμής λάβει 356 αναφορές. Στις 7/12/2016 έγινε δεκτή η αίτησή μου στο Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών για χρηματοδότηση διατριβής με αντικείμενο την υπολογιστική και πειραματική μελέτη του RNA editing φαινομένου στα microRNAs, μέσα από μια υποτροφία διάρκειας 36 μηνών.