Regulation of microRNAs during activation of macrophages

Abstract

Endotoxin tolerance occurs to protect the organism from hyperactivation of innate immune responses, primarily mediated by macrophages. Regulation of endotoxin tolerance occurs at multiple levels of cell responses and requires significant changes in gene expression. During macrophage activation, induced expression of miR-155 and miR-146a contributes to the regulation of the inflammatory response and endotoxin tolerance. Herein, we demonstrate that expression of both miRNAs is co-ordinately regulated during endotoxin tolerance by a complex mechanism involving mono-allelic inter-chromosomal association, alterations in histone methyl marks and transcription factor binding. Upon activation of naïve macrophages, Histone3 was tri-methylated at lysine4 (H3K4me3) and NFBp65 was bound on both miR-155 and miR-146a gene loci. However, at the stage of endotoxin tolerance both miR gene loci were occupied by C/EBPβ, NFBp50 and the repressive Histone3 marks H3K9me3. DNA fluorescence in situ hybridization (DNA-FISH) experiments revealed mono-allelic inter-chromosomal co-localization of miR-155 and miR-146a gene loci at the stage of endotoxin tolerance, while RNA-DNA-FISH experiments showed that the co-localized alleles were silenced, suggesting a common repressive mechanism. Genetic ablation of Akt1, which is known to abrogate endotoxin tolerance, abolished induction of loci co-localization and C/EBPβ binding, further supporting that this mechanism occurs specifically in endotoxin tolerance. This thesis demonstrates that two miRNAs are co-ordinately regulated via gene co-localization at the three dimensional chromatin space, similar transcriptional machinery and Histone3 methylation profile, contributing to the development of endotoxin tolerance. Further insight into the role of AKT in regulation of M1/M2 polarization, revealed the essential role of these microRNAs in macrophage phenotype. Akt1 ablation promotes miR-155 expression in LPS-stimulated macrophage. Measuring miR-155 in Akt2-depleted macrophages revealed that Akt2 ablation had the opposite effect, reducing miR-155 expression in both resting and LPS-activated macrophages. Therefore, down-regulation of miR-155 in Akt2-defiecient macrophages results in up-regulation of its target C/EBPβ and, consequently, in the induction of Arg1, a hallmark of M2 macrophage polarization. Akt2 deficiency resulted, however, in a significant upregulation of miR-146a, which mediates M1 phenotype suppression and assure endotoxin tolerance. miR-146a transfection in WT macrophages was able to inhibit iNOS induction while miR-146a suppression in Akt2-depleted mice resulted in upregulation of iNOS expression. The physiological and clinical significance of these miRs in sepsis was supported by further data in humans. Critically ill patients with impaired immune responses (CARS syndrome) are associated with increased miR-155 and miR-146 expression. In vivo transferring of these miRs by using amphoteric liposomes seems to be highly promising, underlining miR-155 and miR-146 as potential novel molecular biomarkers of macrophage sensitivity and CARS syndrome and tools for therapeutic purposes.

Η ανοσολογική ανοχή είναι απαραίτητη για την προστασία του οργανισμού από την υπερ-ενεργοποίηση της ανοσολογικής απόκρισης και διαμεσολαβείται κυρίως μέσω μακροφάγων. Η ρύθμιση της ανοσολογικής ανοχής συντελείται σε πολλαπλά επίπεδα και απαιτεί σημαντικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Κατά τη διαδικασία της ενεργοποίησης των μακροφάγων, η επαγόμενη έκφραση του miR-155 και miR-146a συμβάλλει στη ρύθμιση της φλεγμονώδους απόκρισης και της ανοσολογικής ανοχής. Στην παρούσα διατριβή, αποδεικνύεται ότι η έκφραση και των δύο miRNAs συν-ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια της ανοσολογικής ανοχής μέσω ενός πολύπλοκου μηχανισμού που περιλαμβάνει χρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις, μεταβολές στο πρότυπο μεθυλίωσης των ιστονών και μεταβολές στην πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων. Κατά την ενεργοποίηση των μακροφάγων, παρατηρείται τρι-μεθυλίωση της λυσίνης 4 στην ιστόνη H3 (H3K4me3) και πρόσδεση του NFBp65 στους υποκινητές των γονιδίων miR-155 και miR-146a. Ωστόσο, κατά το στάδιο της ανοσολογικής ανοχής παρατηρείται τρι-μεθυλίωση της ιστόνης Η3 στην λυσίνη 9 (H3K9me3) και πρόσδεση των μεταγραφικών παραγόντων C/ΕΒΡβ και NFBp50.DNA-FISH πειράματα αποκάλυψαν την αλληλεπίδραση των γονιδιακών τόπων του miR-155 και miR-146a στο ένα αλλήλιο, στο στάδιο της ανοσολογικής ανοχής, ενώ πειράματα RNA-DNA-FISH έδειξαν ότι όταν αυτοί οι γονιδιακοί τόποι συνεντοπίζονται, δεν παρατηρείται μεταγραφή των γονιδίων τους, αποδεικνύοντας έναν κοινό μηχανισμό σίγησης. Στην περίπτωση των AKT1-/- ποντικών, στα οποία καταργείται το φαινόμενο της ανοσολογικής ανοχής, δεν παρατηρείται συνεντοπισμός των γονιδιακών τόπων, υποστηρίζοντας περαιτέρω ότι αυτός ο μηχανισμός συμβαίνει ειδικά κατά το στάδιο της ανοχής των μακροφάγων. Επομένως, δύο miRNAs συν-ρυθμίζονται μέσω αλληλεπίδρασης των γονιδιακών τους τόπων, μέσω κοινών μεταγραφικών παραγόντων και παρόμοιου προφίλ μεθυλίωσης της ιστόνης Η3, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη της ανοσολογικής ανοχής. Επιπλέον, η ανάλυση του ρόλου της ΑΚΤ κινάσης στα διάφορα στάδια ενεργοποίησης των μακροφάγων και στον M1 / M2 φαινότυπο ανέδειξε τη σημαντική συμβολή αυτών των microRNAs. Η απαλοιφή του γονιδίου Akt1 προήγαγε την έκφραση του miR-155 στα LPS-διεγερμένα μακροφάγα. Η μέτρηση των επιπέδων του miR-155 σε Akt2 - / - μακροφάγα αποκάλυψε το αντίθετο αποτέλεσμα. Ως εκ τούτου, η μείωση της έκφρασης του miR-155 στα Akt2 - / - μακροφάγα είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή του στόχου του, του C/ΕΒΡβ και, κατά συνέπεια, την επαγωγή της Arg1, πρωτείνης που εκφράζεται στον Μ2 φαινότυπο. Αντιστοίχως, η απαλοιφή της Akt2 οδήγησε σε σημαντική αύξηση της έκφρασης του miR-146a, το οποίο παίζει κρίσιμο ρόλο στην καταστολή του φαινοτύπου M1 και στην εξασφάλιση της ανοσολογικής ανοχής. Η επαγωγή του miR-146a σε WT μακροφάγα ήταν ικανή να αναστείλει την επαγωγή της iNOS ενώ η καταστολή του miR-146a σε Akt2 - / - μακροφάγα είχε σαν αποτέλεσμα της αύξηση της έκφρασης της iNOS. Η κλινική σημασία των ευρημάτων αυτών στη σήψη και την ανοσολογική ανοχή υποστηρίχθηκε από περαιτέρω πειραματικά δεδομένα σε ανθώπινα δείγματα. Σε βαρέως πάσχοντες ασθενείς με μειωμένη ανοσολογική απόκριση (σύνδρομο CARS), όπως αυτή χαρακτηρίζεται από τη μειωμένη ανταπόκριση –παραγωγή κυτταροκινών στο πλάσμα έπειτα απο την ex vivo επώαση του περιφερικού αίματος με LPS, παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του miR-155 και miR-146. Η in vivo μεταφορά αυτών των Mirs με τη βοήθεια λιποσωμάτων ήταν ο επόμενος στόχος που επετεύχθη, πράγμα που καθιστά αυτά τα δύο Mirs πιθανούς μοριακούς δείκτες του συνδρόμου CARS και εργαλεία για θεραπευτικούς σκοπούς.