Διερεύνηση των μηχανισμών νεκρωτικού θανάτου στο νηματώδη Caenorhabditis elegans

Abstract

Necrotic cell death underlies extensive neuronal loss in acute degenerative episodes, such as ischemic stroke, and in devastating human pathologies, like neurodegenerative diseases (Martin, 2001; Syntichaki and Tavernarakis, 2002). In the nematode Caenorhabditis elegans, hyperactivation of specific ion channels or hypoxia evoke an analogous pattern of neuronal death (Driscoll and Chalfie, 1991; Scott et al., 2002). Investigations in both nematodes and mammals implicate specific calpains and aspartyl proteases in the execution of necrotic cell death (Syntichaki and Tavernarakis, 2002; Yoshida et al., 2002). Aspartyl proteases achieve full activity under acidic conditions (Goll et al., 2003; Ishidoh and Kominami, 2002). However, the factors that induce aberrant activation of these otherwise benign enzymes during necrosis have been largely unknown. In this thesis we show that the function of the vacuolar H+-ATPase, a pump that acidifies endosomal and lysosomal compartments, is essential for the execution of necrotic cell death in the nematode Caenorhabditis elegans. Indeed, impairment of the vacuolar H+- ATPase function or alkalization of normally acidic intracellular organelles by weak bases protected against necrosis. The use of pH-sensitive green fluorescent protein (GFP)- molecules revealed reduction of cytoplasmic pH in dying cells. Intracellular acidification required the vacuolar H+-ATPase function. Suppression of necrosis by aspartyl protease but not calpain deficiency was further enhanced by conditions that perturbed intracellular acidification. Thus, intracellular pH is an important modulator of necrosis in C. elegans. We propose that the vacuolar H+-ATPase activity is required to establish necrosis-promoting acidic intracellular conditions that augment the function of executioner aspartyl proteases in degenerating cells. However, the origin of cytoplasmic acidification remained obscure. Mutations in genes that affect lysosomal biogenesis and function had a significant impact on necrotic death levels. By using a genetically encoded fluorescent marker to monitor lysosomal fate during necrosis in vivo, we found that lysosomes fuse and localize around a swollen nucleus. However, in advanced stages of cell death GFP–labeled lysosomal membranes faded, indicating lysosomal rupture. In conjunction with the effect of endocytic oganelle alkalization on necrotic death, the sum of our data suggests that lysosomes have a prominent role in cellular destruction during necrosis and facilitate pH reduction by releasing their acidic content. Similar mechanisms may contribute to necrotic cell death that follows extreme acidosis—for example, during stroke—in humans. The lysosomal system participates via the autophagic process to the degradation of intracellular proteins and organelles. We checked the involvement of autophagy in necrosis and found that it is required for necrotic death in C. elegans. Impairment of autophagy by genetic inactivation of autophagy genes or by pharmacological treatment suppressed necrosis. Excessive autophagosome formation was induced early during neurodegeneration. At more pronounced stages autophagosomes accumulated in the nucleus periphery, where they exhibited partial or complete colocalization with lysosomes and mitochondria. Autophagy induction was preceded by calpain activation and synergized with lysosomal catabolic mechanisms to facilitate cell death. These findings demonstrate that autophagy contributes to cellular destruction during necrosis. Thus, interfering with the autophagic process may protect neurons against necrotic damage in humans.

Ο νεκρωτικός κυτταρικός θάνατος ευθύνεται για την εκτεταμένη απώλεια κυττάρων υπό ακραίες συνθήκες και συντελείται συνήθως κατά τη διάρκεια έντονων εκφυλιστικών επεισοδίων, όπως τα εγκεφαλικά και οι ισχαιμίες, καθώς και σε νευροεκφυλιστικές παθολογικές καταστάσεις του ανθρώπου (Martin, 2001; Syntichaki and Tavernarakis, 2002). Ανάλογο πρότυπο κυτταρικού θανάτου είναι δυνατόν να επαχθεί στο νηματώδη Caenorhabditis elegans λόγω υπερενεργοποίησης ιοντικών καναλιών ή χαμηλής συγκέντρωσης οξυγόνου (Driscoll and Chalfie, 1991; Scott et al., 2002). Μελέτες τόσο σε νηματώδεις όσο και σε θηλαστικά έχουν δείξει ότι η νεκρωτική καταστροφή των κυττάρων πραγματοποιείται με τη συμμετοχή καλπαϊνών και πρωτεασών ασπαρτικού (Syntichaki and Tavernarakis, 2002; Yoshida et al., 2002). Η μέγιστη ενεργότητα των τελευταίων επιτυγχάνεται υπό όξινες συνθήκες (Goll et al., 2003; Ishidoh and Kominami, 2002). Ωστόσο, οι παράγοντες που προκαλούν μη φυσιολογική και υπερβολική ενεργοποίηση αυτών των ενζύμων κατά τη νέκρωση δεν είναι γνωστοί. Δεδομένα που παρουσιάζονται στην παρούσα διατριβή υποδεικνύουν ότι η λειτουργία των κυστιδιακών ΑΤΡασών πρωτονίων, που συμβάλλουν στην οξίνιση ενδοσωμικών και λυσοσωμικών διαμερισμάτων του κυττάρου, απαιτείται για τη νέκρωση στο νηματώδη C. elegans. Παρεμπόδιση της δραστηριότητάς τους κατέστειλε σημαντικά το νεκρωτικό θάνατο. Τα επίπεδα νέκρωσης μειώθηκαν επίσης μετά από επώαση ζώων σε διαλύματα ασθενών βάσεων, που προκαλούν αύξηση στο pH φυσιολογικά όξινων ενδοκυτταρικών οργανιδίων. Η παρακολούθηση των μεταβολών του pH, με τη χρήση μορφών της φθορίζουσας πρωτεΐνης GFP ευαίσθητων στις συνθήκες οξύτητας, αποκάλυψε ότι συμβαίνει οξίνιση του κυτταροπλάσματος σε εκφυλιζόμενα κύτταρα υπό την προϋπόθεση ότι εκφράζουν λειτουργικές κυστιδιακές ΑΤΡάσες. Η δυσλειτουργία αυτών ενίσχυσε επιπλέον την καταστολή της νέκρωσης σε νηματώδεις με δυσλειτουργικές πρωτεάσες ασπαρτικού. Δεν παρατηρήθηκε ωστόσο περαιτέρω αύξηση του κυτταρικού θανάτου σε ζώα με μειωμένη ενεργότητα καλπαϊνών. Συμπερασματικά, το ενδοκυτταρικό pH παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της νέκρωσης στο C. elegans. Προτείνεται ότι η δράση των κυστιδιακών ΑΤΡασών απαιτείται για τη δημιουργία όξινων συνθηκών που προωθούν το νεκρωτικό θάνατο, αυξάνοντας πιθανά την ενεργότητα εκτελεστικών πρωτεασών ασπαρτικού στα εκφυλιζόμενα κύτταρα.