Functional investigation of NAT genes in bacteria and fungi of biotechnological interest

Abstract

Aromatic amines represent an important group of organic pollutants, which are becoming increasingly abundant in the environment as a result of modern industrial activity and farming. Since aromatic amines are toxic to organisms, their widespread environmental occurrence has raised global concerns and efforts to develop effective bioremediation methods are intense. Investigations show that microorganisms have developed metabolic pathways, which enable them to tolerate xenobiotics or to exploit them as sources of nutrients and energy. One of these pathways of microbial xenobiotic metabolism leads to detoxification of aromatic amines through N-acetylation, a conjugation reaction catalyzed by homologs of the NAT enzyme family. The broader aim of the study was to investigate the role of NAT genes in xenobiotic metabolism of different prokaryotic and eukaryotic microorganisms, as well as to explore other potential functions attributed to certain NAT homologs.A primary aim of the Thesis was to phenotype different bacteria with regard to their ability to tolerate and metabolize the aromatic amine 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA), particularly through NAT mediated N-acetylation. This compound is encountered as a polluting byproduct of herbicides and other anthropogenic chemicals. During the study, two taxonomically broad collections of bacterial isolates were employed, available from collaborators. Continuing previous studies of the group, 20 isolates of the "ELTE collection" (obtained from natural or polluted environmental sources) and 26 isolates of the "MED-DUTH collection" (obtained from the human gut) were phenotyped as to their sensitivity towards 3,4-DCA. The 107 isolates (85 species) of both bacterial collections combined were then phenotyped with relation to their metabolic activity towards 3,4-DCA, using thin layer chromatography (TLC) to detect biotransformation of the aromatic amine added to cultures. The majority (93%) of isolates, covering the entire taxonomic range investigated, demonstrated viability in 3,4-DCA concentrations that did not exceed 200 μg/mL (1.2 mM). The two phenotypes examined, i.e. xenobiotic sensitivity and metabolic activity, were not demonstrably associated. Under the experimental conditions applied, only a small number (19%) of bacterial isolates was phenotyped as metabolically active towards 3,4-DCA. Generation of N-acetylated 3,4-DCA was evident only for 14% of bacterial species (mainly bacilli and streptomycetes) and was found to be directly linked to the presence of NAT genes in their genome. However, it is unclear whether NAT could be involved in other biotransformation activities detected in about 5% of the species investigated. Among bacteria which demonstrated high (> 1000 μg/mL, > 6.2 mM) tolerance of 3,4-DCA, the corynebacterium Tsukamurella paurometabola was of particular interest, as previous studies in the lab have shown that its NAT homolog, designated symbol (TSUPD)NAT1, has higher N-malonyltransferase than N-acetyltransferase activity. Therefore, xenobiotic sensitivity of T. paurometabola was investigated more thoroughly, using a panel of 9 additional aromatic amine and hydrazine compounds (including antimicrobial drugs like isoniazid), known to serve as acceptor substrates of recombinant (TSUPD)NAT1 protein in vitro. Although the bacterium demonstrated resilience towards many of the aromatic amines tested, it appeared unable to metabolize any of those compounds. Given that xenobiotics may also be released as secondary metabolites by competing microorganisms, T. paurometabola was also subjected to co-culture assays with nine isolates of the genus Streptomyces (ELTE collection), considered as efficient producers of biologically active compounds. In most cases, growth of T. paurometabola (an opportunistic pathogen of human) was inhibited during co-culture with a streptomycete, suggesting production of secondary metabolites with potentially useful antimicrobial properties. Another major aim of the Thesis was to investigate the impact of NAT gene deletion on growth, xenobiotic sensitivity and metabolism of the ascomycete Fusarium verticillioides. This maize-pathogenic fungus is known to overcome the toxic effect of phytoanticipin 2-benzoxazolinone (BOA) produced by its host plant, as well as the BOA metabolic derivative 2-aminophenol (2AP), through a NAT-mediated pathway. For this study, the "USDA-ARS collection" available from collaborators was employed, comprising 37 strains of the fungus, including wild type, as well as single (ΔNAT1, ΔNAT2, ΔNAT3), double (ΔNAT1/ΔNAT2, ΔNAT1/ΔNAT3, ΔNAT2/ΔNAT3) and triple (ΔNAT1/ΔNAT2/ΔNAT3) NAT gene knockout strains. Initially, growth of wild type and NAT gene knockout strains was assessed in different media, demonstrating no apparent effect of NAT gene deletion on fungal growth (including when acetate, propionate, malonate or succinate was added to cultures as additional carbon source). Xenobiotic sensitivity of F. verticillioides (wild type strain) was then investigated, using a panel of 14 xenobiotic compounds, followed by sensitivity screens of strains representative of all eight NAT genotypes (wild type and deletion mutants) against three particular xenobiotics, two natural (BOA and 2AP) and one anthropogenic (3,4-DCA). Consistent with previous literature, the results demonstrated that the NAT1 N-malonyltransferase (primarily) and the NAT3 N-acetyltransferase homologs of F. verticillioides are important for detoxification of BOA and aromatic amine xenobiotics, while the role of NAT2 isoenzyme remains unknown. Additional work was carried out in order to explore the possible influence of NAT genes on the broader adaptability of F. verticillioides to biotic challenges from other microorganisms (ELTE and MED-DUTH collections), and to assess whether such interactions could be modified by additional xenobiotic stress with BOA or 3,4-DCA. In the course of this analysis, bacterial sensitivity to BOA and its metabolic derivative 2AP was also assessed. Although F. verticillioides NAT1 deficient strains were less fit to grow in xenobiotic amended co-cultures, there was no apparent link between NAT genotype and the ability of the fungus to compete with the bacterial isolates tested.Finally, this project initiated investigations into the postulated functions of more divergent microbial NAT homologs. An extensive genomic survey was conducted in order to update the list of formally annotated NAT genes found in sequenced eukaryotic microorganisms (protists and fungi). Bioinformatics resources were further exploited in order to examine the possible association of NAT genes with genomic clusters of secondary metabolism in eukaryotic microorganisms. Indeed, this in silico screening identified 103 gene clusters bearing NAT loci in 69 sequenced fungal species of ascomycetes and basidiomycetes. Given that the aromatic amine 3-amino-5-hydroxybenzoic acid (3,5-AHBA) is known to serve as starter unit in the biosynthesis of several polyketide metabolites, enzymatic assays were carried out using 6 recombinant NAT proteins from two phytopathogenic Fusarium species (F. verticillioides and F. graminearum). These proteins were also employed to investigate possible fungal NAT-mediated hydrolysis of acyl-CoA in the absence of acceptor substrate. Finally, a more thorough investigation was carried out for the functionally divergent NAT1 malonyltransferase of F. verticillioides, designated symbol (GIMBO)NAT1, through enzyme kinetic analysis of recombinant protein assayed with its preferred donor substrate malonyl-CoA, followed by recombinant protein crystallography. The Thesis generated original scientific knowledge about the role of microbial NAT genes in xenobiotic metabolism, also expanding our understanding of the functional divergence of this enzyme family, which is considered to have a very interesting evolutionary history. The observations made suggested possible biotechnological utility of certain microorganisms with NAT genes in their genome, e.g. by employing bacteria tolerant and/or metabolically active towards aromatic amines in future bioremediation regimens, or by developing novel biocontrol strategies to combat F. verticillioides via inhibition of NAT gene expression or enzymatic activity of its protein product.

Οι αρωματικές αμίνες είναι ξενοβιοτικές ενώσεις που αποτελούν σημαντική κατηγορία περιβαλλοντικών ρύπων, λόγω της εντατικής χρήσης τους στη χημική βιομηχανία και τη γεωργία. Δεδομένης της υψηλής τοξικότητάς τους για τους οργανισμούς, οι μεγάλες ποσότητες αρωματικών αμινών που απελευθερώνονται στο περιβάλλον έχουν εγείρει προβληματισμό σε παγκόσμιο επίπεδο, ενώ καταβάλλονται προσπάθειες προκειμένου να αναπτυχθούν περισσότερο αποδοτικές μέθοδοι βιοαποικοδόμησής τους. Είναι γνωστό ότι οι μικροοργανισμοί έχουν αναπτύξει μεταβολικούς μηχανισμούς που τους επιτρέπουν να επιβιώνουν παρουσία ξενοβιοτικών ουσιών, ή ακόμα και να αξιοποιούν τις ενώσεις αυτές ως πηγή θρεπτικών συστατικών και ενέργειας. Μία από αυτές τις βιοχημικές οδούς περιλαμβάνει τη Ν-ακετυλίωση των αρωματικών αμινών μέσω της δράσης των Ν-ακετυλοτρανσφερασών της ενζυμικής οικογένειας ΝΑΤ. Ευρύτερος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος των γονιδίων ΝΑΤ στον ξενοβιοτικό μεταβολισμό διαφόρων προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών μικροοργανισμών, καθώς επίσης να μελετηθούν άλλες πιθανές λειτουργίες ορισμένων λιγότερο συντηρημένων ομολόγων ΝΑΤ. Ένας βασικός στόχος της διατριβής ήταν η φαινοτύπηση διαφόρων βακτηρίων ως προς την ικανότητά τους να ανέχονται και να μεταβολίζουν την αρωματική αμίνη 3,4-διχλωροανιλίνη (3,4-DCA), ειδικά μέσω Ν-ακετυλίωσης από τα ένζυμα ΝΑΤ. Η συγκεκριμένη αρωματική αμίνη απαντά ως περιβαλλοντικός ρύπος προερχόμενος από τη διάσπαση φυτοφαρμάκων και άλλων ανθρωπογενών χημικών. Στη διάρκεια της μελέτης αξιοποιήθηκαν δύο ευρείες ταξινομικά συλλογές βακτηριακών στελεχών που ήταν διαθέσιμες στο εργαστήριο από συνεργάτες. Συνεχίζοντας προηγούμενες μελέτες του Εργαστηρίου, εξετάστηκαν 20 βακτηριακά στελέχη από την αποκαλούμενη "συλλογή ELTE" και 26 στελέχη από την αποκαλούμενη "συλλογή MED-DUTH", τα οποία είχαν αντιστοίχως απομονωθεί είτε από περιβαλλοντικά δείγματα είτε από την ανθρώπινη εντερική μικροχλωρίδα. Τα στελέχη αυτά φαινοτυπήθηκαν ως προς την ευαισθησία τους έναντι της 3,4-DCA. Στη συνέχεια, τα συνολικά 107 στελέχη (85 βακτηριακά είδη) και των δύο συλλογών φαινοτυπήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να μεταβολίζουν τη συγκεκριμένη αρωματική αμίνη, χρησιμοποιώντας χρωματογραφία λεπτής στιβάδας προκειμένου να ανιχνευθούν τυχόν μεταβολίτες της 3,4-DCA στο θρεπτικό μέσο των καλλιεργειών. Η πλειοψηφία (93%) των στελεχών, η οποία κάλυπτε ολόκληρο το μελετούμενο ταξινομικό εύρος μικροοργανισμών, εμφάνισε βιωσιμότητα σε συγκεντρώσεις 3,4-DCA μέχρι 200 μg/mL (1.2 mM). Ωστόσο, οι δύο εξεταζόμενοι φαινότυποι, δηλ. η βιωσιμότητα σε 3,4-DCA και η ικανότητα κάθε βακτηριακού στελέχους να μεταβολίζει την αρωματική αμίνη, δεν φάνηκαν να συσχετίζονται. Σχετικά μικρός (19%) ήταν ο αριθμός των στελεχών που βρέθηκαν να είναι μεταβολικά ενεργά ως προς την υπό μελέτη διχλωροανιλίνη. Η δε ικανότητα παραγωγής Ν-ακετυλιωμένης 3,4-DCA παρατηρήθηκε μόνο στο 14% των βακτηριακών ειδών (κυρίως βάκιλλοι και στρεπτομύκητες), ενώ ο φαινότυπος αυτός βρέθηκε να συνδέεται άμεσα με την παρουσία γονιδίων ΝΑΤ στο γονιδίωμα των συγκεκριμένων μικροβίων. Πέραν της Ν-ακετυλίωσης, ένα μικρό ποσοστό (5%) των βακτηριακών ειδών που εξετάστηκαν διαπιστώθηκε ότι είναι ικανό να πραγματοποιεί άλλων τύπων βιομετατροπές της αρωματικής αμίνης, χωρίς να είναι εμφανές αν τα γονίδια ΝΑΤ μπορεί να παίζουν κάποιο ρόλο.Ανάμεσα στα βακτήρια που παρουσίασαν υψηλή ανεκτικότητα (> 1000 μg/mL, > 6.2 mM) ως προς την 3,4-DCA, το κορυνοβακτηρίδιο Tsukamurella paurometabola παρουσίασε ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς προηγούμενες μελέτες του Εργαστηρίου είχαν δείξει ότι το ένζυμο ΝΑΤ, με επίσημο σύμβολο (TSUPD)NAT1, του συγκεκριμένου βακτηρίου εμφανίζει δραστικότητα Ν-μαλονυλοτρανσφεράσης παρά Ν-ακετυλοτρανσφεράσης. Η ευαισθησία σε ξενοβιοτικά του βακτηρίου αυτού μελετήθηκε επομένως περισσότερο διεξοδικά, χρησιμοποιώντας συνολικά εννέα διαφορετικές αρωματικές αμίνες και υδραζίνες, οι οποίες ήταν ήδη γνωστό ότι αποτελούν υποστρώματα του ανασυνδυασμένου ενζύμου (TSUPD)NAT1 in vitro. Παρά το γεγονός ότι το βακτήριο παρουσίασε υψηλή ανεκτικότητα έναντι αρκετών από τις ξενοβιοτικές ουσίες που μελετήθηκαν, δεν φάνηκε να είναι ικανό να μεταβολίζει καμία από αυτές. Επιπλέον, δεδομένου ότι ξενοβιοτικές ενώσεις είναι δυνατό να απελευθερώνονται και ως αποτέλεσμα ανταγωνιστικής αλληλεπίδρασης μεταξύ μικροοργανισμών, το βακτήριο T. paurometabola υποβλήθηκε σε πειράματα συγκαλλιέργειας με εννέα διαφορετικά στελέχη του γένους Streptomyces (συλλογή ELTE) που είναι γνωστό ότι διαθέτουν πλούσιο δευτερογενή μεταβολισμό. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η ανάπτυξη του βακτηρίου T. paurometabola (το οποίο είναι δυνητικά παθογόνο του ανθρώπου) φάνηκε να αναστέλλεται από την παρουσία στρεπτομυκήτων, πιθανότατα λόγω απελευθέρωσης από αυτούς ουσιών με ενδεχομένως χρήσιμη αντιμικροβιακή δράση. Άλλος βασικός στόχος της διατριβής ήταν να μελετηθεί η επίδραση της απαλοιφής των γονιδίων NAT στην ανάπτυξη, την ευαισθησία, αλλά και την ικανότητα μεταβολισμού ξενοβιοτικών ουσιών, στον ασκομύκητα Fusarium verticillioides. Ο συγκεκριμένος φυτοπαθογόνος μύκητας κατορθώνει να αποτοξικοποιεί την φυτοαντισιπίνη 2-βενζοξαζολινόνη (ΒΟΑ) που παράγεται ως άμυνα από το φυτό-ξενιστή (καλαμπόκι), όπως επίσης και το βασικό μεταβολίτη του ΒΟΑ που είναι η 2-αμινοφαινόλη (2AP), μέσω δράσης ενζύμων ΝΑΤ. Για τους σκοπούς της παρούσας μελέτης αξιοποιήθηκε μια συλλογή 37 στελεχών του F. verticillioides (αποκαλούμενη "συλλογή USDA-ARS", διαθέσιμη από συνεργάτη), η οποία περιλαμβάνει στελέχη αγρίου τύπου, καθώς και στελέχη στα οποία έχει πραγματοποιηθεί απαλοιφή ενός (ΔNAT1, ΔNAT2, ΔNAT3), δύο (ΔNAT1/ΔNAT2, ΔNAT1/ΔNAT3, ΔNAT2/ΔNAT3) ή και των τριών γονιδίων ΝΑΤ (ΔNAT1/ΔNAT2/ΔNAT3) του μύκητα. Τα στελέχη αυτά αρχικά καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικά θρεπτικά μέσα (π.χ. παρουσία οξικού, προπιονικού, μηλονικού ή ηλεκτρικού ως πρόσθετης πηγής άνθρακα), ωστόσο η απώλεια των γονιδίων ΝΑΤ δεν διαπιστώθηκε να έχει κάποια επίπτωση στην ικανότητα του μύκητα να αναπτύσσεται σε διαφορετικές συνθήκες. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η ικανότητα του αγρίου τύπου μύκητα να αναπτύσσεται παρουσία 14 διαφορετικών ξενοβιοτικών ενώσεων. Τρεις από τις ενώσεις αυτές (BOA, 2AP και 3,4-DCA) χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω προκειμένου να διερευνηθεί η επίπτωση της απαλοιφής των γονιδίων ΝΑΤ στη βιωσιμότητα και τον ξενοβιοτικό μεταβολισμό του μύκητα. Σε συμφωνία με την προϋπάρχουσα βιβλιογραφία, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κυρίως η ΝΑΤ1 μαλονυλοτρασφεραση και λιγότερο η ΝΑΤ3 ακετυλοτρασφεράση του μύκητα παίζουν σημαντικό ρόλο στην αποτοξικοποίηση των ξενοβιοτικών ουσιών, ενώ ο ρόλος του ισοενζύμου ΝΑΤ2 παραμένει άγνωστος. Ακόμη, διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος των γονιδίων ΝΑΤ στην ευρύτερη ικανότητα του F. verticillioides να ανταπεξέρχεται του ανταγωνισμού άλλων μικροοργανισμών (βακτηριακά στελέχη των συλλογών ELTE και MED-DUTH), παρουσία ή απουσία ξενοβιοτικών ενώσεων (BOA ή 3,4-DCA). Για το σκοπό αυτό, αρχικά μελετήθηκε η ευαισθησία των βακτηρίων που χρησιμοποιήθηκαν στην έρευνα, έναντι του BOA και του μεταβολικού παραγώγου του 2AP. Παρά το γεγονός ότι η απουσία του γονιδίου ΝΑΤ1 φάνηκε να επηρεάζει σημαντικά την ικανότητα του μύκητα να επιβιώνει παρουσία των ξενοβιοτικών ενώσεων, ωστόσο τα γονίδια ΝΑΤ δεν φάνηκε να έχουν κάποιο εμφανή ρόλο στην αλληλεπίδραση μεταξύ των συγκαλλιεργούμενων μικροοργανισμών. Τέλος, η παρούσα διατριβή επιχείρησε να μελετήσει άλλους πιθανούς ρόλους των γονιδίων ΝΑΤ των μικροοργανισμών, πέραν του ξενοβιοτικού μεταβολισμού. Για το σκοπό αυτό, αρχικά, πραγματοποιήθηκε μια εκτεταμένη υπολογιστική ανασκόπηση βάσεων δεδομένων για τον εντοπισμό γονιδίων ΝΑΤ σε ευκαρυωτικούς μικροοργανισμούς (πρώτιστα και μύκητες) που έχουν αλληλουχηθεί πρόσφατα. Οι αλληλουχίες αυτές αποτέλεσαν τη βάση για περαιτέρω βιοπληροφορική μελέτη που είχε στόχο να διερευνήσει την πιθανή συσχέτιση των γονιδίων ΝΑΤ με βιοσυνθετικά μονοπάτια του δευτερογενούς μεταβολισμού. Πράγματι, η μελέτη προσδιόρισε 103 συστοιχίες γονιδίων στο γονιδίωμα 69 ασκομυκήτων και βασιδιομυκήτων, οι οποίες βρέθηκε να περιλαμβάνουν γονίδια ΝΑΤ. Καθώς, η αρωματική αμίνη 3-αμινο-5-υδροξυβενζοϊκό οξύ (3,5-AHBA) είναι γνωστό ότι χρησιμοποιείται από τους μικροοργανισμούς για τη βιοσύνθεση πολυκετιδικών δευτερογενών μεταβολιτών, ακολούθως διερευνήθηκε η ικανότητα των ανασυνδυασμένων ενζύμων ΝΑΤ δύο φυτοπαθογόνων μυκήτων του γένους Fusarium (F. verticillioides and F. graminearum) να χρησιμοποιούν την ένωση αυτή ως υπόστρωμα δέκτη. Επιπλέον, διερευνήθηκε η ικανότητα των ενζύμων αυτών να υδρολύουν υπόστρωμα ακυλο-συνένζυμο Α απουσία υποστρώματος δέκτη. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μια πιο διεξοδική λειτουργική μελέτη για το ανασυνδυασμένο ισοένζυμο ΝΑΤ1 του F. verticillioides, το οποίο φέρει επίσημο σύμβολο (GIBMO)NAT1, μέσω κινητικής ανάλυσης με το επιλεκτικό υπόστρωμα δότη μαλόνυλο-συνένζυμο Α, ενώ η μελέτη ολοκληρώθηκε με κρυσταλλογραφική ανάλυση της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Η παρούσα διατριβή παρέχει πρωτότυπη επιστημονική γνώση πάνω στο ρόλο των μικροβιακών γονιδίων ΝΑΤ στον ξενοβιοτικό μεταβολισμό, επεκτείνοντας επιπλέον την κατανόησή μας σχετικά με τη λειτουργική διαφοροποίηση της συγκεκριμένης ενζυμικής οικογένειας που πιστεύεται ότι έχει πολύ ενδιαφέρουσα εξελικτική ιστορία. Με βάση τις παρατηρήσεις της μελέτης προτείνονται επίσης ορισμένες πιθανές εφαρμογές προς διερεύνηση, π.χ. μέσω της χρήσης σε πρωτόκολλα βιοαποκατάστασης μικροοργανισμών που βρέθηκε ότι ανέχονται και μεταβολίζουν τοξικές αρωματικές αμίνες μέσω των ενζύμων ΝΑΤ που διαθέτουν. Επίσης, η αναστολή είτε της έκφρασης των γονιδίων ΝΑΤ είτε της ενζυμικής ενεργότητας των αντίστοιχων πρωτεϊνικών προϊόντων τους θα μπορούσε να διερευνηθεί ως μέσο βιολογικού ελέγχου του φυτοπαθογόνου μύκητα F. verticillioides που προσβάλλει το καλαμπόκι.