Μοριακή μελέτη και έλεγχος αντοχής σε αντιιικά φάρμακα, στελεχών ιών γρίπης Α απομονωθέντων στη Β. Ελλάδα

Abstract

Molecular analysis and antiviral resistance of influenza A viruses isolated in N. Greece. Influenza viruses A are characterized by their unique genome structure, with 8 segmented RNA molecules. This structure causes genetic instability with antigenic drift and shift events occurring frequently, especially to the genes of the external glycoproteins, haemagglutinin and neuraminidase. Mutation events also happen to the internal protein genes, like matrix protein 2, that influence the sensitivity of the virus to the antiviral drugs, amantadine and rimantadine. Specific neuraminidase gene mutations also cause viral resistance to oseltamivir and zanamivir. The purpose of this study was the molecular analysis of influenza viruses A(H3N2) which circulated in Northern Greece during the last 3 influenza seasons, 2004-2005, 2005-2006, and 2006- 2007, their correlation with strains isolated from different countries at the same season and their comparison with the corresponding vaccine strains. Through the molecular analysis of NA and M2 genes, the resistance to NA and M2 inhibitors was also examined. Cell and egg culture techniques were used for the isolation of the viruses , while molecular techniques, such as one step RT-PCR and DNA sequencing, were used for detecting the viruses and the mutations of the haemagglutinin, neuraminidase and matrix protein 2 genes. Our results are as follows: In N. Greece different strains circulated each season, with variations from the strains that circulated the same season worldwide. Even during the same season and within the same circulating subtype, it seems that the isolated strains belonged to more than two phylogenetic clades. N. Greek strains were different from the vaccine strains A/Fujian/411/2002 and A/California/7/2004 during the influenza periods 2004-2005 and 2005-2006, whereas during 2006-2007 our strains belonged to the same phylogenetic clade with the vaccine strain A/Wisconsin/67/2005. By the molecular analysis of matrix protein 2 and neuraminidase genes, it was found that inflenza A(H3N2) viruses that circulated after 2005, were mostly resistant to adamantanes, whereas strains that circulated during 2004-2007 were all sensitive to NA inhibitors, oseltamivir and zanamivir. Because of the special structure of the influenza genome, constant surveillance of yearly variations is of great importance, so that vaccine strains can be evaluated. According to the surveillance results, the greek policy for the use of available antiviral drugs has to be modified to confront yearly epidemics or the threating new pandemic.

Οι ιοί της γρίπης Α χαρακτηρίζονται από το κατακερματισμένο σε 8 τμήματα RNA γονιδίωμά τους, που τους προσδίδει γενετική αστάθεια. Οι εξωτερικές πρωτεΐνες και αντιγόνα του ιού, η αιμοσυγκολλητίνη και η νευραμινιδάση, είναι εκείνες στις οποίες παρατηρούνται συχνά τα φαινόμενα αντιγονικής εκτροπής και μεταβολής. Κάποιες από τις μεταλλάξεις στη νευραμινιδάση του ιού, προκαλούν ανθεκτικότητα στην οσελταμιβίρη και τη ζαναμιβίρη, ενώ μεταλλάξεις που συμβαίνουν και σε εσωτερικές πρωτεΐνες του ιού, όπως στη μητρική πρωτεΐνη 2, επηρεάζουν την ευαισθησία του στα αντιιικά φάρμακα, αμανταδίνη και ριμανταδίνη. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η μοριακή ανάλυση των ιών της γρίπης Α(Η3Ν2) που κυκλοφόρησαν στη Βόρεια Ελλάδα κατά τις τρεις τελευταίες περιόδους γρίπης, 2004-2005, 2005-2006 και 2006-2007, η συσχέτιση τους με στελέχη της ίδιας εποχής από άλλες χώρες, η σύγκριση αυτών με τα στελέχη του εμβολίου και ο έλεγχος της ευαισθησίας τους στα αντιιιικά φάρμακα αμανταδίνη, ριμανταδίνη και οσελταμιβίρη, ζαναμιβίρη. Χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές καλλιεργητικής απομόνωσης των ιών σε κύτταρα MDCK και εμβρυοφόρα αβγά όρνιθας και μοριακές τεχνικές για την ανίχνευση των ιών και την ανεύρεση μεταλλάξεων στα γονίδια της αιμοσυγκολλητίνης, της νευραμινιδάσης και της μητρικής πρωτεΐνης 2. Από τη μελέτη μας προέκυψε ότι τα στελέχη της Β. Ελλάδας ήταν διαφορετικά κάθε χρόνο και με παραλλαγές από εκείνα που κυκλοφόρησαν παγκοσμίως. Σε κάθε μία περίοδο γρίπης φαίνεται ότι ακόμα και τα στελέχη του ίδιου υποτύπου που κυκλοφορούσαν ανήκαν τουλάχιστον σε 2 διαφορετικούς κλάδους, διακινούμενους συγχρόνως. Σε σύγκριση με τα στελέχη των εμβολίων, από τη μελέτη μας προέκυψε ότι κατά τις περιόδους 2004-2005 και 2005-2006 τα στελέχη που κυκλοφόρησαν απείχαν στην πλειοψηφία τους από τα στελέχη του εμβολίου Α/Fujian/411/2002 και A/California/7/2004. Αντίθετα, κατά την περίοδο 2006-2007 τα στελέχη που κυκλοφόρησαν ανήκαν στον ίδιο φυλογενετικό κλάδο με το στέλεχος του εμβολίου Α/Wisconsin/67/2005. Από τη μοριακή ανάλυση της μητρικής πρωτεΐνης 2 και της νευραμινιδάσης βρέθηκε ότι από το 2005 και μετά, στη Β. Ελλάδα κυκλοφορούν στελέχη ανθεκτικά στις αδαμαντάνες, ενώ όλα τα στελέχη της τριετίας που εξετάσθηκαν βρέθηκαν ευαίσθητα στους αναστολείς της νευραμινιδάσης, οσελταμιβίρη και ζαναμιβίρη. Φαίνεται λοιπόν ότι είναι ιδιαίτερα σημαντική η συνεχής παρακολούθηση των ετήσιων μεταβολών των ιών, ώστε να αξιολογούνται τα ετήσια εμβόλια και η προστασία την οποία παρέχουν. Να αξιολογούνται ακόμη τα αντιιικά φάρμακα, ώστε η πολιτική χρήσης τους να μεταβάλλεται ανάλογα με την αποτελεσματικότητά τους για να αντιμετωπίζονται οι ετήσιες επιδημίες αλλά και μία τυχόν πανδημία κατά τον καλύτερο δυνατό τρόπο.