Συγκριτική γονιδιωματική και λειτουργική μελέτη ενζύμων του ξενοβιοτικού μεταβολισμού

Abstract

Arylamine N-acetyltransferases (NAT) are enzymes of xenobiotic metabolism and typically catalyse the transfer of an acetyl-group to arylamines. Humans carry two functional genes, NAT1 and NAT2 which are polymorphic. Many of their alleles encode enzymes with reduced activity that could be related to adverse drug reactions and high susceptibility to the harmful effects of carcinogens.Functional studies have demonstrated that human NAT proteins are a difficult experimental material. In the present thesis, a comparative genomic and functional investigation was undertaken, in order to characterise the NAT homologues of non-human primates that were expected to provide a better experimental material for in vitro studies. Thus, the NAT genes of 11 primate species were cloned. The generated recombinant proteins were studied by enzymatic activity assays and by differential scanning fluorimetry (DSF). Assays were performed with different NAT1- and NAT2-selective substrates. Structural modelling was further used to visualise the proteins. Taking into consideration the overall amount of expressed recombinant protein, the thermal stability and the enzymatic activity, the NAT1 proteins of M. mulatta/M. sylvanus and N. gabriellae, as well as the NAT2 protein of E. patas are proposed as the most suitable models of human NATs. Furthermore, these results may be useful for studies into the evolutionary history of NAT enzymes in primates. Sequencing of the NAT1 and NAT2 genes from a M. mulatta population has revealed the existence of 14 non-synonymous polymorphisms which were examined for possible functional effects on the recombinant expression, enzyme activity, thermal stability and structure of the corresponding rhesus NAT allozymes. Most polymorphisms reduced the enzymatic activity. Notably, polymorphism p.Asp142Tyr caused a considerable increase in the thermal stability and enzymatic activity of the NAT2 protein. Of particular interest was polymorphism p.Val231Ile, which caused significant reduction in the enzymatic activity measured with NAT2-selective substrates, while increasing the enzymatic activity with the NAT1-selective substrates and this effect has not been documented previously for any other polymorphic NAT enzyme and thus, it was thoroughly studied. The enzymatic activity was measured, complemented by immunoblot analysis, DSF and computational modeling. The results showed that polymorphism p.Val231Ile rather affects the enzyme affinity for different substrates and changes its selectivity to resemble the selectivity of the NAT1 homologues. The work of this thesis was further expanded by the application of crystallography and surface plasmon resonance. The comparative investigation of NAT in primates allows for better understanding of their role in xenobiotic metabolism and facilitates the identification of functional residues that may have been subjected to the pressures of natural selection. The present thesis has generated original scientific knowledge and novel experimental material which are expected to support future studies.

Οι Ν-ακετυλοτρανσφεράσες των αρυλαμινών (ΝΑΤ) είναι ένζυμα του ξενοβιοτικού μεταβολισμού που καταλύουν τη μεταφορά της ακετυλομάδας από το ακετυλοσυνένζυμο-Α σε αρυλαμίνες. Στον άνθρωπο υπάρχουν δύο λειτουργικά γονίδια, τα ΝΑΤ1 και ΝΑΤ2 που είναι πολυμορφικά. Πολλά από τα αλληλόμορφά τους κωδικοποιούν αλλοένζυμα με μειωμένη ενεργότητα και αυτό είναι δυνατό να επηρεάζει την εξατομικευμένη απόκριση σε φάρμακα ή την ευαισθησία σε καρκινογόνα. Λειτουργικές μελέτες έχουν καταδείξει ότι οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ΝΑΤ του ανθρώπου αποτελούν δύσχρηστο πειραματικό υλικό. Στην παρούσα διατριβή επιχειρείται συγκριτική γονιδιωματική και λειτουργική μελέτη, προκειμένου να ταυτοποιηθούν πρωτεΐνες ΝΑΤ πρωτευόντων οι οποίες να είναι υψηλά ομόλογες προς του ανθρώπου και να υπερτερούν ως πειραματικό υλικό in vitro. Για το σκοπό αυτό, κλωνοποιήθηκαν τα γονίδια ΝΑΤ 11 πρωτευόντων. Οι ανασυνδυασμένες ΝΑΤ πρωτεΐνες μελετήθηκαν με τεχνικές μέτρησης ενζυμικής ενεργότητας και διαφορικής σάρωσης φθορομετρίας (DSF). Χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικά ΝΑΤ1- και ΝΑΤ2-επιλεκτικά υποστρώματα, και οι πρωτεΐνες μελετήθηκαν περαιτέρω με μοντελοποίηση της τρισδιάστατης δομής τους. Λαμβάνοντας υπ’ όψη την ποσότητα της εκφρασμένης πρωτεΐνης, τη θερμική σταθερότητα και την ενζυμική ενεργότητα, οι πρωτεΐνες ΝΑΤ1 των M. mulatta/M. sylvanus, ΝΑΤ1 του N. gabriellae και ΝΑΤ2 του E. patas προτείνονται ως οι καταλληλότερες για χρήση ως μοντέλων μελέτης των ανθρώπινων ΝΑΤ. Επιπλέον, τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούν να αξιοποιηθούν και στο πλαίσιο μελετών της εξελικτικής ιστορίας των ΝΑΤ στα πρωτεύοντα.Η αλληλούχηση των γονιδίων ΝΑΤ1 και ΝΑΤ2 ενός πληθυσμού του είδους M. mulatta προσδιόρισε την ύπαρξη 14 μη συνώνυμων πολυμορφισμών, οι οποίοι μελετήθηκαν ως προς τις λειτουργικές επιπτώσεις τους στην ανασυνδυασμένη έκφραση, την ενεργότητα, τη θερμική σταθερότητα και τη δομή των αντίστοιχων αλλοενζύμων ΝΑΤ. Η πλειοψηφία των πολυμορφισμών οδήγησε σε μείωση της ενζυμικής ενεργότητας. Αξιοσημείωτη ήταν η λειτουργική επίπτωση του πολυμορφισμού p.Asp142Tyr, ο οποίος προκάλεσε αύξηση στη θερμική σταθερότητα και ενεργότητα της πρωτεΐνης ΝΑΤ2. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασε ο πολυμορφισμός p.Val231Ile, όπου παρατηρήθηκε μείωση της ενεργότητας παρουσία ΝΑΤ2-επιλεκτικών υποστρωμάτων, ενώ αντίθετα παρατηρήθηκε αύξηση έναντι των ΝΑΤ1-επιλεκτικών, γεγονός που δεν έχει παρατηρηθεί προηγουμένως για κανένα ισοένζυμο ΝΑΤ και γι’αυτό μελετήθηκε περαιτέρω. Πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις της ενζυμικής ενεργότητας, πειράματα ενζυμικής κινητικής και πειράματα ανοσοαπoτύπωσης και DSF, καθώς και υπολογιστική μελέτη της δομής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο πολυμορφισμός p.Val231Ile επιδρά κυρίως αλλάζοντας τη συγγένεια του ενζύμου έναντι διαφορετικών υποστρωμάτων και η επιλεκτικότητα του ισοενζύμου ΝΑΤ2 μεταβάλλεται ώστε να προσομοιάζει αυτήν του ισοενζύμου ΝΑΤ1.Η διατριβή αυτή συμπληρώνεται με την εφαρμογή της κρυσταλλογραφίας και της τεχνολογίας του συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων. Η διεξαγωγή συγκριτικών μελετών των ΝΑΤ σε διαφορετικά πρωτεύοντα επιτρέπει την καλύτερη κατανόηση του ρόλου τους στον ξενοβιοτικό μεταβολισμό και διευκολύνει τον προσδιορισμό λειτουργικών στοιχείων πάνω στα οποία πιθανόν έχει δράσει η φυσική επιλογή. Η παρούσα μελέτη παρείχε πρωτότυπη επιστημονική γνώση που αναμένεται να διευκολύνει τις μελλοντικές μελέτες.