Development of nanodispersions as carriers for bioactive compouds and their biological applications

Abstract

The aim of this thesis was initially the formulation of nanodispersions, as carriers of bioactive compounds and also their biological evaluation as potent delivery systems. Two types of nanodispersions, namely micro- and nanoemulsions were formulated and structurally characterized, performing different methods. The nanodispersions were used as matrices for the nanoencapsulation of bioactive compounds with pharmacological interest including chemotherapeutic and anti-inflammatory agents. The study of structural characteristics was performed by viscosity measurements, Dynamic Light Scattering (DLS), Electron Paramagnetic Resonance Spectrometry (EPR) and Cryogenic Transmission Electron Microscopy (cryo-TEM). The measurements were conducted in both empty nanodispersions and loaded nanodispersions with bioactive compounds. The structural study revealed both differences and similarities, induced both by the different composition of the formulated delivery systems and by the encapsulation of the bioactive compounds. In order to evaluate the efficacy of nanodispersions in biological applications, both in vitro and ex vivo assays were performed. The cytotoxic effect of both drug free and loaded nanodispersions, was examined through cell viability assays. For this purpose, selected colorectal and skin cancer cell lines, namely WM 164, Caco-2, HT-29 and Colon 205 were used. The mechanism of the cell death caused by the bioactive compounds was investigated through different techniques, among them Fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis, Comet assay and Western Blotting of specific cell death and apoptosis markers. Overall, it was found that oil-in-water (o/w) nanodispersions are appropriate delivery systems of the bioactive compounds in all cell lines tested. The ex vivo experiments included different assays, namely ex vivo permeation study through Franz cell device and differential tape stripping. Through the ex vivo approach, it was found that the encapsulated compounds were promptly distributed within full-thickness of stratum corneum (SC). Moreover, the quantity of the bioactive compounds that may enter the blood circulation was determined. Subsequently, the proposed o/w nanodispersions are proper carriers to deliver bioactive compounds through skin and improve the dermal/transdermal administration of the encapsulated compounds.

Ο κύριος στόχος αυτής της μελέτης ήταν αρχικά η ανάπτυξη νανοδιασπορών ως φορέων των βιοδραστικών ενώσεων καθώς και η αποτίμηση της βιολογικής τους δρασης ως πιθανά συστήματα χορήγησης των βιοδραστικών ενώσεων. Αναπτύχθηκαν δύο τύποι νανοδιασπορών, τα μικρο- και νανογαλακτώματα, τα οποία χαρακτηρίστηκαν δομικά, χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους. Οι νανοδιασπορές χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρες για την ενθυλάκωση βιοδραστικών ενώσεων με φαρμακολογικό ενδιαφέρον όπως χημειοθεραπευτικοί και αντιφλεγμονωδεις παράγοντες. Η μελέτη των δομικών χαρακτηριστικών πραγματοποιήθηκε με μετρήσεις ιξώδους καθώς και με χρήση Δυναμικής Σκέδασης Φωτός (DLS), φασματοσκοπίας Ηλεκτρονικού Παραμαγνητικού Συντονισμού (EPR) και Κρυογονικής Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας (cryo-TEM). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν τόσο απουσία όσο και παρουσία βιοδραστικών ενώσεων, στις νανοδιασπορές. Η δομική μελέτη αποκάλυψε τις διαφοροποιήσεις που προκαλούνται τόσο από τη διαφορετική σύσταση των νανοδιασπορών, όσο από την ενθυλάκωση των βιοδραστικών ενώσεων. Προκειμένου να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα των νανοδιασπορών σε βιολογικές εφαρμογές, διεξήχθησαν πειράματα in vitro και ex νίνο. Η κυτταροτοξική επίδραση τόσο των νανογαλακτωμάτων ως φορέων όσο και των ενθυλακωμένων βιοδραστικών ενώσεων εξετάστηκε μέσω μελέτης κυτταρικής βιωσιμότητας κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν επιλεγμένες κυτταρικές σειρές όπως η WM 164, Caco-2, ΗΤ 29 και Colon 205. Ο μηχανισμός του επαγόμενου κυτταρικού θανάτου διερευνήθηκε μέσω κυτταρομετρίας ροής (FACS), ανάλυσης Comet και ανοσοτύπωσης κατά Western με χρήση δεικτών κυτταρικού θανάτου και απόπτωσης. Διαπιστώθηκε ότι η προτεινόμενες νανοδιασπορές είναι κατάλληλες ως φορείς βιοδραστικών ενώσεων. Τα ex νίνο πειράματα περιλάμβαναν τη μελέτη διαπερατότητας μέσω συσκευής Franz και την τεχνική differential tape stripping. Μέσω της ex νίνο προσέγγισης, βρέθηκε ότι οι ενθυλακωμένες ενώσεις κατανεμήθηκαν στην κεράτινη στιβάδα. Επιπλέον, προσδιορίστηκε η ποσότητα της βιοδραστικής ένωσης που μπορεί πιθανά να εισέλθει στην κυκλοφορία του αίματος. Ως αποτέλεσμα, οι προτεινόμενες νανοδιασπορές είναι κατάλληλοι φορείς για την μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων μέσω του δέρματος καθώς και την ενίσχυση της δερματικής/διαδερμικής απελευθέρωσης τους.