Σχέσεις δομής-λειτουργίας στους μεταφορείς πουρινών μυκήτων

Abstract

Fungi possess plasma membrane transporters specific for the uptake of purines and pyrimidines from their growth media. Up to date, four nucleobase transporters, (UapA, UapC, AzgA, FurD) have been characterized in A. nidulans and two (Fcy2p, Fur4p) in S. cerevisiae. The first part of this PhD Thesis concerns structure-function relationship studies of the UapA transporter, predicted to consist of twelve transmembrane segments (TMSs). Firstly, site-directed mutagenesis revealed that N409 is essential for transport catalysis and is part of the substrate binding site. In parallel, a systematic mutational analysis was performed for residue F528, at the core of TMS12, in conjunction with studies on combination of mutations in F528 with mutations in Q408. The results of the above studies revealed an allele-specific interaction between Q408 and F528. Moreover, deletion of the predicted TMS12 resulted in retention of the protein to the endoplasmic reticulum. Analysis of chimeric proteins where the TM12 region of UapA was substituted with the corresponding region of homologous transporters showed that basic determinants for substrate binding should lie exterior to TMS12. Finally, the role of N71 was studied with site-directed mutagenesis, showing that it plays a fine role in determining its specificity. Moreover, the study of chimeric constructs where the region of TMS1 has been substituted with the analogous region of UapC, suggested that in this region are located residues affecting transporter folding and/or targeting to the plasma membrane. In the second part of the present PhD Thesis, an Aspergillus nidulans gene, called fcyB, was cloned and characterised. FcyB was found to be a low-capacity, high-affinity purine-cytosine permease. Deletion of fcyB does not affect growth, development, reproduction or bulk purine uptake, but eliminates the leaky growth on purines of strains, lacking all known purine transporters, and confers resistance to the antifungal 5-fluorocytosine. fcyB transcription is highly activated during germination but drops at low constitutive levels throughout vegetative development. A strain expressing FcyB-GFP revealed an abundant expression in sexual and asexual compartments. FcyB-GFP was also shown to be downregulated by endocytosis in response to ammonia or the presence of cytosine.

Οι μύκητες διαθέτουν διαμεμβρανικούς μεταφορείς για την πρόσληψη πουρινών και πυριμιδινών από το περιβάλλον, η μελέτη των οποίων παρουσιάζει έντονο βιολογικό ενδιαφέρον. Μέχρι σήμερα, τέσσερις μεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων (UapA, UapC, AzgA, FurD) έχουν χαρακτηριστεί στον A. nidulans και δύο (Fur4p, Fcy2p) στον S. cerevisiae. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκαν οι σχέσεις δομής-λειτουργίας του UapA, ο οποίος αποτελείται από δώδεκα διαμεμβρανικά τμήματα (TMSs). Αρχικά με κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση διαπιστώθηκε ότι η Ν409 είναι απαραίτητη για τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης, όντας ένα από τα αμινοξέα του ενεργού κέντρου. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε ανάλυση μεταλλαγών στην F528, στο TMS12, καθώς και συνδυασμών τους με μεταλλαγές στην Q408, από όπου διαπιστώθηκε ότι οι μεταλλαγές στην Q408 και την F528 αλληλεπιδρούν γενετικά με εξειδικευμένο τρόπο. Παράλληλα, διαπιστώθηκε ότι η απαλοιφή του TMS12 οδηγεί σε συγκράτηση της πρωτεΐνης στο ενδοπλασματικό δίκτυο, ενώ με τη βοήθεια χιμαιρικών μορίων όπου το TMS12 του UapA είχε αντικατασταθεί από το αντίστοιχο τμήμα ομόλογων μεταφορέων φάνηκε ότι οι βασικοί καθοριστές της αναγνώρισης και μεταφοράς των υποστρωμάτων εντοπίζονται εκτός του TMS12. Τέλος, μελετήθηκε με κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση η Ν71 και φάνηκε ότι συμμετέχει στον καθορισμό της εξειδίκευσης του μεταφορέα,. Παράλληλα, από τη μελέτη χιμαιρικού μεταφορέα, όπου το TMS1 του UapA είχε αντικατασταθεί από το αντίστοιχο τμήμα του UapC, διαπιστώθηκε ότι η περιοχή αυτή είναι σημαντική για την αναδίπλωση ή/και στόχευση του μεταφορέα στην πλασματική μεμβράνη. Στο δεύτερο σκέλος της διατριβής πραγματοποιήθηκε λειτουργικός χαρακτηρισμός ενός νέου μεταφορέα του A. nidulans, του FcyB. Από τη μελέτη αυτή διαπιστώθηκε ότι ο FcyB είναι ένας χαμηλής απόδοσης, υψηλής συγγένειας, μεταφορέας κυτοσίνης-πουρίνης. Εξάλειψη του fcyB δεν επηρεάζει την αύξηση, την ανάπτυξη, την αναπαραγωγή, αλλά εκμηδενίζει την εναπομένουσα αύξηση σε πουρίνες μεταλλαγμένων στελεχών όπου απουσιάζουν όλοι οι γνωστοί μεταφορείς πουρινών και προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιμυκητιακό ανάλογο 5-φθοροκυτοσίνη. Η μεταγραφή του fcyB επάγεται κατά τη διάρκεια της εκβλάστησης, αλλά μειώνεται δραματικά σε σταθερά χαμηλά επίπεδα κατά τη βλαστητική ανάπτυξη. Η χρήση στελέχους που εκφράζει χιμαιρική πρωτεΐνη FcyB-GFP αποκάλυψε υψηλά επίπεδα έκφρασης σε φυλετικές και αφυλετικές δομές και ότι ενδοκυτώνεται σε απόκριση σε αμμωνία ή παρουσία κυτοσίνης.