Development of microemulsions for the administration of bioactive compounds

Abstract

Microemulsions, as liquid colloidal systems, have attracted the scientific interest mainly in the field of pharmaceuticals and foods, as they serve as excellent hosts for compound encapsulation increasing their final bioavailability. The aim of the present thesis was the formulation of biocompatible microemulsions based mainly on natural oils and biocompatible surfactants in order to serve as hosts for the encapsulation of natural bioactive compounds of therapeutic interest. Two (2) different routes of administration of high user compliance were studied in the present work in order to exploit the multi-functional nature of the formulated colloidal dispersions. Different microemulsions were formulated, for the encapsulation of bioactive compounds, belonging to the category of water-in-oil (W/O) systems. The structural characterization of the microemulsions was conducted by means of Dynamic Light Scattering(DLS), Electron Paramagnetic Resonance (EPR), Dynamic Interfacial Tension (DIT) and Small Angle X-ray Scattering (SAXS) techniques. In order to study their future application as pharmaceutical formulations two (2) different types of bioactive compounds (enzymes and antioxidants) were encapsulated in the novel systems. Due to the polar nature of the dispersed phase of a W/O system the following hydrophilic compounds were chosen for encapsulation: the enzyme Horseradish peroxidase (HRP) and the natural antioxidants hydroxytyrosol (HT) and gallic acid (GA). Structural characterization shed light to the dimensions of the systems but also revealed information about the localization of the bioactive compounds in the complex microstructure. In order to study the efficacy of the formulations regarding their ability to protect the encapsulated compounds and to increase their bioavailability, the proposed studied systems were examined with proper techniques. Kinetic studies were conducted in the case of HRP encapsulation and antioxidant activity was investigated with the use of EPR following antioxidants’ encapsulation. The studies revealed that the encapsulated compounds retained their activity after the encapsulation, enhancing the suitability of the microemulsions for pharmaceutical applications, as they are able to maintain the properties of their hosts.For the biological assessment of the proposed formulations two (2) different routes of administration were studied namely oral and nasal. In detail, the study focused on the absorption of the encapsulated bioactives after oral and nasal administration in the intestine and nasal cavity, respectively. As a result, in vitro techniques were used in order to understand the microemulsions’ effect on the absorption of bioactive compounds following administration. For both administration routes the appropriate cancer cell lines were used for in vitro studies, including cell viability and epithelial permeability assays. In order to exploit the absorption after oral administration of the microemulsions the intestinal co-culture model Caco-2/TC7 with HT29-MTX was used whereas, for nasal in vitro studies RPMI2650 cell line was selected as the most appropriate. The in vitro assessments revealed the appropriate concentrations of the systems in order not to provoke any cytotoxic effect while the permeability assays in constructed epithelia indicated the strong participation of the microemulsion’s ingredients in the transport profile of the bioactive compounds. To conclude with, novel W/O microemulsions with the use of biocompatible ingredients were formulated serving as excellent hosts for bioactive compounds with therapeutic interest such as enzymes and antioxidants. The suitability of the proposed systems for oral and nasal delivery demonstrated the significant benefits of liquid-in-liquid nanodispersions arising from their microstructure and ingredients. The present study forms the basis for the development of pharmaceutical products which will combine a cost-effective strategy with high patient compliance.

Τα μικρογαλακτώματα, ως υγρά κολλοειδή συστήματα, έχουν συγκεντρώσει το επιστημονικό ενδιαφέρον, ιδιαίτερα του τομέα φαρμάκων και τροφίμων, καθώς αποτελούν άριστο περιβάλλον εγκλωβισμού ουσιών αυξάνοντας ταυτόχρονα τη βιοδιαθεσιμότητά τους. Σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η ανάπτυξη βιοσυμβατών μικρογαλακτωμάτων βασισμένων, κυρίως, σε φυσικά έλαια και επιφανειοενεργά με σκοπό τη χρήση τους στον εγκλωβισμό ουσιών με θεραπευτικό ενδιαφέρον. Δύο (2) διαφορετικές οδοί χορήγησης βιοδραστικών ουσιών μελετήθηκαν στο πλαίσιο της συγκεκριμένης διατριβής με σκοπό τη μελέτη της πολυ-λειτουργικής φύσης των υγρών νανοδιασπορών σε φαρμακευτικές εφαρμογές. Διαφορετικά μικρογαλακτώματα, που ανήκαν στην κατηγορία τύπου νερού-σε-έλαιο(Ν/Ε) αναπτύχθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας μελέτης και τελικά χρησιμοποιήθηκαν για τον εγκλωβισμό βιοδραστικών ουσιών. Ο δομικός χαρακτηρισμός των μικρογαλακτωμάτων, πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των τεχνικών της Δυναμικής Σκέδασης Φωτός (DLS), του Ηλεκτρονικού Παραμαγνητικού Συντονισμού (EPR), της Δυναμικής Επιφανειακής Τάσης (DIT) και της Σκέδασης ακτινών-Χ υπό μικρή γωνία (SAXS). Στα αναπτυχθέντα συστήματα εγκλωβίστηκαν δύο (2) διαφορετικοί τύποι βιοδραστικών ουσιών (ένζυμα και αντιοξειδωτικά). Λόγω της πολικής φύσης της διεσπαρμένης φάσης των συστημάτων εγκλωβίστηκαν το ένζυμο Υπεροξειδάση του χρένου (Horseradish peroxidase, HRP) και τα φυσικά αντιοξειδωτικά υδροξυτυροσόλη (hydroxytyrosol, ΗΤ) και γαλλικό οξύ (gallic acid,GA). Η μελέτη των δομικών χαρακτηριστικών των συστημάτων απουσία και παρουσία των βιοδραστικών ουσιών, καθώς και οι αλλαγές αυτών, έδωσαν πληροφορίες σχετικά με το μέγεθος των διασπορών των αναπτυχθέντων μικρογαλακτωμάτων αλλά και συντέλεσαν στον προσδιορισμό της θέσης των ουσιών στην πολύπλοκη μικροδομή τους. Για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας των συστημάτων, τα προτεινόμενα μικρογαλακτώματα ελέγχθηκαν είτε ως προς την ικανότητά τους να καταλύουν γνωστές αντιδράσεις (στην περίπτωση εγκλωβισμού ενζύμου) είτε να διατηρούν την αντιοξειδωτική ικανότητα των εγκλωβισμένων ουσιών (στην περίπτωση της υδροξυτυροσόλης και του γαλλικού οξέος). Διαπιστώθηκε ότι οι εγκλωβισμένες ουσίες διατήρησαν τις αρχικές τους ιδιότητες μετά τον εγκλωβισμό τους, ενώ τα ίδια τα μικρογαλακτώματα λόγω της φύσης τους εμφάνισαν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση, αυξάνοντας την καταλληλότητα τους για χρήση σε φαρμακευτικές εφαρμογές. Για τη βιολογική αποτίμηση των προτεινόμενων συστημάτων δύο (2) διαφορετικοί οδοί χορήγησης μελετήθηκαν: η από του στόματος και η ρινική. Συγκεκριμένα, η μελέτη εστιάστηκε στην συμπεριφορά των μικρογαλακτωμάτων και στην συμβολή τους στην απορρόφηση των εγκλωβισμένων βιοδραστικών ουσιών, μέσω in vitro τεχνικών, στις περιοχές απορρόφησης που συνδέονται με την από του στόματος και τη ρινική χορήγηση. Τόσο για την από του στόματος όσο και για τη ρινική χορήγηση πραγματοποιήθηκαν in vitro μελέτες κυτταροτοξικότητας και διαπερατότητας από κατασκευασμένα επιθήλια με τη χρήση κατάλληλων καρκινικών σειρών. Συγκεκριμένα, στην πρώτη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε η συγκαλλιέργεια των εντερικών επιθηλιακών καρκινικών κυτταρικών σειρών Caco-2/TC7 και HT29-MTX, ενώ στη δεύτερη περίπτωση η καρκινική κυτταρική σειρά ρινικού επιθηλίου RPMΙ 2650. Μέσω των in vitro μελετών προσδιορίστηκε το εύροςτων μη τοξικών συγκεντρώσεων των συστημάτων, σε κάθε περίπτωση, ενώ η μελέτη επιθηλιακής διαπερατότητας των βιοδραστικών ουσιών ανέδειξε την ισχυρή συμμετοχή των συστατικών των μικρογαλακτωμάτων στην συγκεκριμένη διαδικασία. Εν κατακλείδι, στο πλαίσιο της συγκεκριμένης διατριβής αναπτύχθηκαν πρωτότυπα βιοσυμβατά μικρογαλακτώματα τα οποία αποτέλεσαν εξαιρετικό μικροπεριβάλλον για τον εγκλωβισμό βιοδραστικών ουσιών όπως ένζυμα και αντιοξειδωτικά. Η καταλληλότητα των παραπάνω συστημάτων για από του στόματος και ρινική χορήγηση ανέδειξε τα πλεονεκτήματα αυτών των συστημάτων. Τα αναπτυχθέντα μικρογαλακτώματα λόγω του μικροπεριβάλλοντός τους, των συστατικών αλλά και των ιδιοτήτων τους μελλοντικά μπορούν να μορφοποιηθούν περαιτέρω με σκοπό την εφαρμογή τους στη φαρμακευτική βιομηχανία ως προϊόντα που θα συνδυάζουν το χαμηλό κόστος και την αποτελεσματικότητα προσφέροντας παράλληλα στον χρήστη έναν εύκολο τρόπο χορήγησης ιδιαίτερα για μακράς διάρκειας θεραπείες.