Συγκριτική μελέτη έκφρασης σε επίπεδο mRNA των αποπτωτικών γονιδίων της BCL2 ομάδας σε ιστοτεμάχια αρθρικού χόνδρου ασθενών που πάσχουν από εκφυλιστική οστεορθρίτιδα

Abstract

Introduction: Osteoarthritis (OA) is primarily characterized by articular cartilage degeneration and chondrocyte loss. Although the role of apoptosis in cartilage pathobiology remains to be elucidated, the apoptotic B‑ cell CLL/lymphoma 2 (BCL2) gene family is considered to be involved in OA degeneration pathways. Purpose: The purpose of the present study was to detect the molecular expression of the BCL2‑ associated X protein (BAX), BCL2 and BCL2L12 genes and quantitatively analyze the mRNA expression profiles of BAX and BCL2 genes in human OA and in normal cartilage. Material/Methods: Cartilage tissue samples were obtained from 78 patients undergoing total knee arthroplasty for OA (OA group) and orthopedic interventions for causes other than OA (control group). Total RNA was isolated from the cartilage tissue specimens and reverse transcribed into cDNA. A highly sensitive and specific reverse transcription quantitative polymerase chain reaction assay was developed for quantification of the mRNA levels of BAX and BCL2, using beta‑ 2 microglobulin as an endogenous control for normalization purposes. Gene expression analysis was performed using the comparative Ct (2(‑ ΔΔCt)) method. Results: For the first time is proven that BCL2L12, the newly cloned gene of the BCL2 family, is expressed in human articular cartilage. Bax, BCL2, and BCL2L12 apoptotic genes are expressed at mRNA level in the tissue specimens of both healthy and OA groups. The mRNA expression of BAX presented an increasing trend in the OA group compared with the control group, although without statistical significance (P=0.099). By contrast, the expression ratio of BCL2/BAX was found to be significantly decreased (2.76‑ fold) in the OA group compared with the normal cartilage controlgroup (P=0.022). A notable 4.6‑ fold overexpression of median mRNA levels of BAX was also observed in patients with stage III OA compared with the control (P=0.034), while the BCL2/BAX ratio was markedly (2.5‑ fold) decreased (P=0.024). A marked positive correlation was observed between the mRNA levels of BAX and BCL2 in the control group (r(s)=0.728; P<0.001), which was also present in the OA group, although to alesser degree (r(s)=0.532; P<0.001). Conclusion: These results further implicate apoptosis in the pathogenesis of OA, through molecular mechanisms, which include the aberrant expression of the BCL2 gene family. Further investigation may reveal novel prognostic biomarkers and potential targets for therapeutic interventions in the early stages of OA.

Εισαγωγή: Η Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) αποτελεί την πιο συχνή χρόνια διαταραχή των αρθρώσεων και χαρακτηρίζεται κυρίως από την εκφύλιση του αρθρικού χόνδρου και την πρωτογενή απώλεια χονδροκυττάρων. Παρότι ο ρόλος του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου στην παθοφυσιολογία του αρθρικού χόνδρου δεν έχει ακόμα πλήρως διευκρυνιστεί, τα αποπτωτικά γονίδια της B‑ cell CLL/lymphoma 2 (BCL2)ομάδας θεωρείται ότι συμμετέχουν στα βιοχημικά μονοπάτια της εκφύλισης του αρθρικού χόνδρου στην ΟΑ. Σκοπός: Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να ανιχνευθεί η μοριακή έκφραση των γονιδίων BCL2‑ associated X protein (BAX), BCL2 and BCL2L12 στην ΟΑ και να γίνει ποσοτική συγκριτική ανάλυση της έκφρασης σε επίπεδο mRNA των γονιδίων BAX και BCL2 στον ανθρώπινο οστεοαρθριτικό και υγιή αρθρικό χόνδρο. Υλικό/Μέθοδος: Πραγματοποιήθηκε η συλλογή δειγμάτων αρθρικού χόνδρου από 78 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε Ολική Αρθροπλαστική Γόνατος λόγω ΟΑ (OAομάδα) και σε ορθοπαιδικές χειρουργικές επεμβάσεις για παθήσεις που δεν σχετίζονταν με ΟΑ (ομάδα ελέγχου). Απομονώθηκε το συνολικό RNA από κάθε ιστοτεμάχιο χόνδρου και υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή προς το αντίστοιχο cDNA. Στη συνέχεια αναπτύχθηκε μία ποσοτική μέθοδος αλυσωτής αντίδρασης πολυμεράσης υψηλής ευαισθησίας και ειδικότητας για την ανίχνευση των υπό μελέτη γονιδίων της BCL2 ομάδας και τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων mRNA των γονιδίων BAX and BCL2, με τη χρησιμοποίηση του γονιδίου της βήτα‑2 μικροσφαιρίνης ως ενδογενές γονίδιο ελέγχου για την κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων. Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκε με τη συγκριτική μέθοδο (2‑ (ΔΔCt)) method. Αποτελέσματα: Η μελέτη αυτή απέδειξε για πρώτη φορά ότι τα ανθρώπινα χονδροκύτταρα εκφράζουν το προσφάτως κλωνοποιημένο αποπτωτικό γονίδιο BCL212. Tόσο τα γνωστά αποπτωτικά γονίδια BCL2, BAX όσο και νέο αυτό γονίδιο τηςBCL2 ομάδας ανιχνεύθηκαν σε επίπεδο mRNA στα ιστοτεμάχια τόσο του υγιούς όσο και του οστεοαρθριτικού χόνδρου. Τα επίπεδα έκφρασης mRNA του γονιδίου BAXπαρουσίασαν αυξητική τάση στην ομάδα της ΟΑ σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, χωρίς όμως στατιστικά σημαντική διαφορά. (P=0.099). Σε αντίθεση όμως με το παραπάνω ο αποπτωτικός λόγος των επιπέδων έκφρασης BCL2/BAX παρατηρήθηκε μειωμένος κατά 2.76 φορές στην ομάδα της ΟΑ σε σχέση με την ομάδα του υγιούς χόνδρου και μάλιστα σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Μια στατιστικά σημαντική επίσης υπερέκφραση κατά 4.6 φορές των μέσων επιπέδων mRNA του γονιδίου BAX παρατηρήθηκε στους ασθενείς με ΟΑ σταδίου III σε σχέση με την ομάδα ελέγχου(P=0.034), ενώ ο λόγος BCL2/BAX ήταν επίσης σε στατιστικά σημαντικό βαθμό μειωμένος κατά 2.5 φορές (P=0.024). Τέλος, παρατηρήθηκε μια έντονα θετική και στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπεδων mRNA έκφρασης των γονιδίωνBAX και BCL2 στην ομάδα του υγιούς χόνδρου (r(s)=0.728; P<0.001), η οποία ανιχνεύθηκε επίσης και στην ομάδα του παθολογικού χόνδρου, αλλά σε μικρότερο βαθμό (r(s)=0.532; P<0.001). Συμπέρασμα: Τα αποτελέσματα της μελέτης εμπλέκουν περαιτέρω την απόπτωση στην παθογένεση της ΟΑ, μέσω μοριακών μηχανισμών που περιλαμβάνουν τη διαταραχή της έκφρασης των αποπτωτικών γονιδίων της BCL2 ομάδας. Η ευρύτερη διερεύνηση του φαινομένου μπορεί να καταλήξει σε νέους προγνωστικούς βιοδείκτες και πιθανούς στόχους για θεραπευτική αντιμετώπιση της ΟΑ στα πρώιμά της στάδια.