Ο ρόλος της ρελαξίνης στις αγγειακές παθήσεις

Abstract

Introduction: Since its discovery in 1926, relaxin has been regarded as a peptide hormone that plays a role in the enlargement of pubic symphysis during the perinatal period. Since then, it has been found to exhibit a variety of biological functions in various organs and systems, especially the cardiovascular system. The specific mechanisms through which it exerts its effects on the cardiovascular system have not yet been elucidated. What is known is that of the three types of relaxin found in humans (RL1, RL2, RL3), the major isoform is relaxin 2, commonly referred to as "relaxin". Relaxin family peptides target specific G protein-coupled receptors (G-coupled receptors), defined as relaxin family peptide receptors (RXFP), of which RXFP1 is the specific receptor for RL2. RL2 has been found to exert some of its biological activity through intracellular nitric oxide (NO), which is a potent vasodilator and its lack or production is a cause of atheromatosis according to modern atherogenesis theories. In other studies it has been found to affect the synthesis of metalloproteinases (MMPs) 2 and 9 in various tissues including the arteries. The role of metalloproteinases is well known in modern theories for aneurysm replacement because of their action on the destruction of collagen fibers and elastin in the aneurysm wall. Therefore, there is a theoretical background linking relaxin to vascular disease, but to date it has only been studied in experimental animals and not in humans. Aim: The purpose of the present study was to investigate the amount of relaxin released in the serum and the expression of the relaxin gene in arterial preparations of patients with atherosclerosis and arterial aneurysm, in relation to the type and severity of vascular disease, as well as in control subjects without evidence of vascular disease. Meanwhile, the potential mechanisms of action of relaxin will be elucidated by simultaneously measuring the expression of MMP-2, MMP-9 and eNOS in arterial preparations. Our aim is to demonstrate any predictive value of relaxin in the presence and severity of vascular disease, as well as the possibility of using relaxin as a biological indicator of early diagnosis of aneurysm and its potential therapeutic applications in atherosclerosis. Experimental design: Comparative observational studyLocation: 1st Clinic of Surgery, National and Kapodistrian University of Athens - Center for Experimental Surgery, Institute of Biomedical Research, Academy of Athens. Subjects: Men and women regardless of age and race undergoing open surgical repair of arterial aneurysm, extracranial carotid disease or peripheral artery disease, classified according to the clinical severity of vascular disease. Healthy blood donors, patients undergoing temporal artery biopsy and cadaveric organ donors / accident victims with no history or clinical evidence of arterial aneurysm, peripheral artery disease or extracranial carotid artery disease were used as controls. Method: The 37 patients treated for vascular disease were categorized into two groups according to the nature of their arterial pathology and each group was further categorized into three subgroups according to the clinical severity of arterial disease, as follows: Atherosclerosis group (ATH group) (n = 21) who underwent surgery for atherosclerotic disease and were further categorized according to the clinical severity of their arterial disease in three subcategories: 1) Atherosclerosis Group 1 (AT1, n = 10): Patients with clinical implications of moderate severity, ie asymptomatic stenosis> 70% of internal carotid artery or severe Rutherford stage 3 intermittent claudication, 2) Atherosclerosis group 2 (AT2, n = 6): Patients with severe functional clinical consequences, ie transient ischemic stroke and stenosis> 50% of internal carotid or Rutherford stage 4 lower extremity ischemic pain and 3) Atherosclerosis Group 3 (n = 5) Patients with permanent clinical disability due to atherosclerosis, ie ischemic stroke and stenosis of> 50% of the internal carotid artery or major / minor ischemic tissue loss of the lower end stage 5 and 6 Rutherford. Arterial aneurysm group (n = 16) who underwent surgical aneurysm repair and were further categorized based on the diameter of the aneurysm and their clinical picture upon admission to the hospital in three subcategories: 1) Arterial aneurysm group 1 (AA1, n = 5): Patients with asymptomatic aneurysm 250-300% of normal artery diameter, 2) Arterial aneurysm group 2 (AA2, n = 4): Patients with asymptomatic aneurysm 300% of normal arterial diameter 3) Arterial aneurysm group 3 (AA3, n = 7): Patients with symptomatic aneurysm or asymptomatic aneurysm diameter> 350% of normal artery diameter. The design of the study provided for the creation of three control groups. In the first control group, patients were selected for probation of prolonged fever and underwent temporal artery biopsy (TAB group, n=6). The second control group of all vascular diseases were healthy blood donors (HBD group, n=10). The third and final control group included cadaveric organ donors, as well as victims of accidents (Autopsy group - AG group, n=10) regardless of gender, age or race, who either underwent part of their abdominal aorta during organ donation (cadaveric donors) or during autopsy (accident victims). Both ATA, AA and TAB groups received both blood and arterial tissue samples. Blood samples were obtained from the HBD group, and arterial tissue samples were obtained from the AG group. ELISA was used to determine the amount of RL2 circulating blood serum, while qRT-PCR was used to determine the amount of RL2, MMP-2, MMP-9 and eNOS mRNA. Results: The serum RL2 of patients with arterial aneurysm, with an indication for treatment, is significantly increased compared to patients and controls who have no history or clinical evidence of aneurysm. The fluctuation of serum RL2 is proportional to the size of the aneurysm and the presence of symptoms therefrom and is significantly increased in patients with aneurysm> 350% of normal diameter or in symptomatic aneurysms compared to smaller or asymptomatic aneurysms. The gene expression of RL2 and MMP-2, MMP-9 and eNOS in aneurysmal arteries> 350% of normal diameter or in symptomatic aneurysms is significantly increased than that observed in smaller aneurysms, atherosclerotic plaques, or normal arteries. Expression of relaxin is not correlated with metalloproteinases in larger and symptomatic aneurysms, suggesting an independent role for RL2 in arterial wall integrity and remodeling in aneurysm. In addition, a negative association of RL2 with MMPs was observed in smaller aneurysms, but not in larger aneurysms, suggesting the involvement of other mechanisms in this multifactorial disease. On the other hand, circulating serum RL2 was increased in the stages of atherosclerosis with mild clinical impact (subclasses AT1 and AT2) and gradually decreased as the disease worsened clinically. At the same time, RL2 increases its expression in atherosclerotic plaques and serum levels, acting as a physiological compensatory mechanism for the decreased blood supply to the milder clinical stages of atherosclerosis, but this mechanism is ameliorated in advanced clinical stages of the disease. Conclusions: RL2 is a peptide that is eligible to be used as a biomarker of aneurysm disease. To confirm the clinical utility of RL2, studies involving patients with smaller aneurysms are also required to determine the reference values above which the general population is likely to develop arterial aneurysms and lead to further selective imaging investigation and intervention based on existing evidence. Finally, the fact that serum RL2 is significantly elevated in symptomatic aneurysms indicates that it may be useful in monitoring patients with smaller aneurysms and in determining which of these patients are at risk of rupture. The fact that RL2 has a negative association with MMP-2 in mild atherosclerosis (subcategory AT1) and a positive association with eNOS in moderate arteriosclerosis (subcategory AT2) indicates that RL2 has a positive effect and could potentially be used therapeutically in atherosclerosis. RL2 may be related to coronary heart disease and its clinical severity, but the small number of patients does not allow any firm conclusions. A study of the serum levels of RL2 in patients with coronary heart disease, classified into subgroups according to the clinical severity of the disease (for example, stable angina, unstable angina, and myocardial infarction) according to our study standards, could answer this question.

Εισαγωγή: Από την ανακάλυψή της το 1926, η ρελαξίνη θεωρήθηκε ως μία πεπτιδική ορμόνη που παίζει ρόλο στην διεύρυνση της ηβικής σύμφυσης κατά την περιγεννητική περίοδο. Έκτοτε, έχει βρεθεί ότι παρουσιάζει πλειάδα βιολογικών λειτουργιών σε διάφορα όργανα και συστήματα, ειδικά στο καρδιαγγειακό σύστημα. Οι ειδικοί μηχανισμοί μέσω των οποίων ασκεί τις δράσεις της στο καρδιαγγειακό σύστημα, δεν έχουν ακόμη αποσαφηνιστεί. Αυτό που είναι γνωστό είναι, ότι από τους τρεις τύπους ρελαξίνης που έχουν βρεθεί στον άνθρωπο (RL1, RL2, RL3), η κύρια ισομορφή είναι η ρελαξίνη 2, που κοινώς αναφέρεται ως ‘’ρελαξίνη’’. Τα πεπτίδια της οικογένεια των ρελαξινών έχουν ως στόχο ειδικούς υποδοχείς συνδεδεμένους με G πρωτεΐνες (G - coupled receptors), που ορίζονται ως υποδοχείς της οικογένειας των πεπτιδίων της ρελαξίνης (relaxin family peptide receptors - RXFP), εκ των οποίων ο RXFP1 θεωρείται ο ειδικός υποδοχέας για την RL2. Η RL2 έχει βρεθεί ότι ασκεί μέρος των βιολογικών της δράσεων μέσω του ενδοκυττάριου μονοξειδίου του αζώτου (nitric oxide - NO), το οποίο αποτελεί ισχυρό αγγειοδιασταλτικό παράγοντα και η έλλειψη ή η μειωμένη παραγωγή του αποτελεί αιτία αθηρωμάτωσης σύμφωνα με τις σύγχρονες θεωρίες αθηρογένεσης. Σε άλλες μελέτες έχει βρεθεί ότι επηρεάζει τη σύνθεση των μεταλλοπρωτεϊνασών (ΜΜΡ) 2 και 9 σε διάφορους ιστούς ανάμεσα στους οποίους και τις αρτηρίες. Ο ρόλος των μεταλλοπρωτεϊνασών είναι γνωστός στις σύγχρονες θεωρίες για την ανευρυσματική εξαλλαγή, λόγω της δράσης τους στην καταστροφή των ινών κολλαγόνου και της ελαστίνης στο τοίχωμα του ανευρυσματικού αγγείου. Επομένως, υπάρχει το θεωρητικό υπόβαθρο, που να συνδέει τη ρελαξίνη με τις αγγειακές παθήσεις, εντούτοις ως σήμερα έχει μελετηθεί μόνο σε πειραματόζωα και όχι στον άνθρωπο. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η μελέτη του ποσού της ρελαξίνης που κυκλοφορεί στον ορό και η έκφραση του γονιδίου της ρελαξίνης σε αρτηριακά παρασκευάσματα ασθενών με αρτηριοσκλήρυνση και αρτηριακό ανεύρυσμα, σε συσχέτιση με το είδος και τη βαρύτητα της αγγειακής πάθησης, καθώς και σε ομάδες ασθενών ελέγχου χωρίς ενδείξεις αγγειακής πάθησης. Ταυτόχρονα θα επιχειρηθεί ανάδειξη των πιθανών μηχανισμών δράσης της ρελαξίνης, με την ταυτόχρονη μέτρηση της έκφρασης των ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και eNOS στα αρτηριακά παρασκευάσματα. Στόχος μας είναι να καταδειχθούν τυχόν προγνωστική αξία της ρελαξίνης ως προς την παρουσία και την βαρύτητα των αγγειακών παθήσεων, καθώς και η δυνατότητα χρήσης της ρελαξίνης ως βιολογικός δείκτης έγκαιρης διάγνωσης της ανευρυσματικής νόσου και οι πιθανές θεραπευτικές εφαρμογές της στην αρτηριοσκλήρυνση. Πειραματικός σχεδιασμός: Συγκριτική μελέτη παρατήρησης Τοποθεσία: Α΄ Χειρουργική Κλινική Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών - Κέντρο Πειραματικής Χειρουργικής, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών. Υποκείμενα: Άνδρες και γυναίκες ανεξαρτήτως ηλικίας και φυλής που υποβλήθηκαν σε ανοικτή χειρουργική αποκατάσταση αρτηριακού ανευρύσματος, εξωκράνιας καρωτιδικής νόσου ή περιφερικής αρτηριοπάθειας, ταξινομημένοι ανάλογα με την κλινική βαρύτητα της αγγειακής πάθησης. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν υγιείς αιμοδότες, ασθενείς που υποβλήθηκαν σε βιοψία κροταφικής αρτηρίας και πτωματικοί δότες οργάνων/θύματα ατυχημάτων, χωρίς ιστορικό ή κλινικές ενδείξεις αρτηριακού ανευρύσματος, περιφερικής αρτηριοπάθειας ή εξωκράνιας καρωτιδικής στένωσης. Μέθοδος: Οι 37 ασθενείς που υπεβλήθησαν σε επέμβαση για αντιμετώπιση αγγειακής πάθησης κατηγοριοποιήθηκαν σε δύο ομάδες ανάλογα με τη φύση της αρτηριακής τους παθολογίας και εν συνεχεία η κάθε ομάδα κατηγοριοποιήθηκε περαιτέρω σε τρεις υποκατηγορίες ανάλογα με την κλινική βαρύτητα της αρτηριακής πάθησης, ως εξής: Ομάδα αρτηριοσκλήρυνσης (Atherosclerosis group – ATH group) (n=21) που υπεβλήθησαν σε χειρουργική επέμβαση για αρτηριοσκληρυντική νόσο και κατηγοριοποιήθηκαν περαιτέρω ανάλογα με την κλινική βαρύτητα της αρτηριακής τους νόσου σε τρεις υποκατηγορίες, ως εξής: 1) Ομάδα αρτηριοσκλήρυνσης 1 (ΑΤΗ1, n=10): Ασθενείς με κλινικές επιπτώσεις μέτριας βαρύτητας, δηλαδή ασυμπτωματική στένωση >70% της έσω καρωτίδας ή σοβαρή διαλείπουσα χωλότητα σταδίου 3 κατά Rutherford, 2) Ομάδα αρτηριοσκλήρυνσης 2 (ΑΤΗ2, n=6): Ασθενείς με σοβαρές λειτουργικές κλινικές επιπτώσεις, δηλαδή παροδικό ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο και στένωση >50% της έσω καρωτίδας ή ισχαιμικό άλγος ανάπαυσης κάτω άκρου σταδίου 4 κατά Rutherford και 3) Ομάδα αρτηριοσκλήρυνσης 3 (ΑΤΗ3, n=5): Ασθενείς με μόνιμη κλινική αναπηρία λόγω της αρτηριοσκλήρυνσης, δηλαδή ισχαιμικό αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο και στένωση >50% της έσω καρωτίδας ή μείζων/ελάσσων ισχαιμική απώλεια ιστού του κάτω άκρου σταδίου 5 και 6 κατά Rutherford. Ομάδα Αρτηριακού ανευρύσματος (Arterial aneurysm group - AA group) (n=16) που υπεβλήθησαν σε χειρουργική αποκατάσταση ανευρύσματος και κατηγοριοποιήθηκαν περαιτέρω με βάση τη διάμετρο του ανευρύσματος και την κλινική εικόνα τους κατά την εισαγωγή στο νοσοκομείο σε τρεις υποκατηγορίες, ως εξής: 1) Ομάδα αρτηριακού ανευρύσματος 1 (ΑΑ1, n=5): Ασθενείς με ασυμπτωματικό ανεύρυσμα διαμέτρου 250-300% της φυσιολογικής διαμέτρου της αρτηρίας, 2) Ομάδα αρτηριακού ανευρύσματος 2 (ΑΑ2, n=4): Ασθενείς με ασυμπτωματικό ανεύρυσμα διαμέτρου 300-350% της φυσιολογικής διαμέτρου της αρτηρίας, 3) Ομάδα αρτηριακού ανευρύσματος 3 (ΑΑ3, n=7): Ασθενείς με συμπτωματικό ανεύρυσμα ή ασυμπτωματικό ανεύρυσμα διαμέτρου >350% της φυσιολογικής διαμέτρου της αρτηρίας. Ο σχεδιασμός της μελέτης προέβλεπε τη δημιουργία τριών ομάδων ελέγχου. Στην πρώτη ομάδα ελέγχου υποψήφιοι για επιλογή ήταν ασθενείς για διερεύνηση παρατεινόμενου εμπυρέτου και υπεβλήθησαν στα πλαίσια της διερεύνησης σε βιοψία κροταφικής αρτηρίας (Temporal artery biopsy group– TAB group, n=6). Στη δεύτερη ομάδα ελέγχου όλων των αγγειακών παθήσεων υποψήφιοι για επιλογή ήταν υγιείς δωρητές αίματος (healthy blood donors – HBD group, n=10). Η τρίτη και τελευταία ομάδα ελέγχου περιλαμβάνει πτωματικούς δότες οργάνων, καθώς και θύματα ατυχημάτων (Autopsy group – AG group, n=10) ανεξαρτήτως φύλου , ηλικίας και φυλής, που είτε υπεβλήθησαν σε λήψη τμήματος της κοιλιακής τους αορτής κατά τη διάρκεια λήψης νεφρού από τη Μονάδα Μεταμόσχευσης Νεφρού του ΓΝΑ «Λαϊκό» (οι πτωματικοί δότες) είτε κατά τη διάρκεια της νεκροτομής (τα θύματα ατυχημάτων). Από τις ομάδες ΑΤΗ, ΑΑ και ΤΑΒ ελήφθησαν τόσο δείγματα αίματος, όσο και αρτηριακοί ιστοί. Από την ομάδα HBD ελήφθησαν δείγματα αίματος, ενώ από την ομάδα AG ελήφθησαν δείγματα αρτηριακού ιστού. Με τη μέθοδο ELISA υπολογίστηκε το πόσο της κυκλοφορούσας στον ορό του αίματος RL2, ενώ με τη μέθοδο qRT-PCR υπολογίστηκε το ποσό του mRNA της RL2, MMP-2, MMP-9 και eNOS. Αποτελέσματα: Η RL2 ορού ασθενών με αρτηριακό ανεύρυσμα, που παρουσιάζει ένδειξη για αντιμετώπιση, είναι σημαντικά αυξημένη σε σχέση με ασθενείς και μάρτυρες που δεν έχουν ιστορικό ή κλινικές ενδείξεις ανευρύσματος. Η διακύμανση της RL2 ορού είναι ανάλογη του μεγέθους του ανευρύσματος και της παρουσίας συμπτωμάτων από το αυτό και είναι σημαντικά αυξημένη σε ασθενείς με ανεύρυσμα >350% της φυσιολογικής διαμέτρου ή σε συμπτωματικά ανευρύσματα σε σχέση με μικρότερα ή ασυμπτωματικά ανευρύσματα. Η γονιδιακή έκφραση της RL2 και των MMP-2, MMP-9 και eNOS σε ανευρυσματικές αρτηρίες >350% της φυσιολογικής διαμέτρου ή σε συμπτωματικά ανευρύσματα είναι σημαντικά αυξημένη σε σχέση με αυτή που παρατηρείται σε μικρότερα ανευρύσματα, αθηρωματικές πλάκες ή φυσιολογικές αρτηρίες. Η έκφραση της ρελαξίνης δεν συσχετίζεται με τις μεταλλοπρωτεϊνάσες σε μεγαλύτερα και σε συμπτωματικά ανευρύσματα, υποδεικνύοντας έναν ανεξάρτητο ρόλο για την RL2 στην ακεραιότητα και την αναδιαμόρφωση του αρτηριακού τοιχώματος στην ανευρυσματική νόσο. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε μια αρνητική συσχέτιση της RL2 με τις MMPs σε μικρότερα ανευρύσματα, η οποία όμως δεν παρατηρείται σε μεγαλύτερα ανευρύσματα, υποδεικνύοντας την εμπλοκή και άλλων μηχανισμών στην πολυπαραγοντική αυτή νόσο. Από την άλλη μεριά, η κυκλοφορούσα στον ορό RL2 ήταν αυξημένη στα στάδια της αρτηριοσκλήρυνσης με ήπια κλινική επίπτωση (υποκατηγορίες ΑΤΗ1 και ΑΤΗ2) και σταδιακά μειώνονταν, καθώς η νόσος επιδεινώνονταν κλινικά. Ταυτόχρονα, η RL2 αυξάνει την έκφρασή της στις αθηρωματικές πλάκες και τα επίπεδά της στον ορό, δρώντας σαν ένα φυσιολογικό αντισταθμιστικό μηχανισμό, που προσπαθεί να αντιρροπήσει την ελαττωμένη αιματική παροχή στα πιο ήπια κλινικά στάδια της αρτηριοσκλήρυνσης, αλλά φαίνεται ότι ο μηχανισμός αυτός υπολειτουργεί, καθώς η αρτηριοσκλήρυνση εξελίσσεται σε προχωρημένα κλινικά στάδια της νόσου. Συμπεράσματα: Η RL2 αποτελεί ένα πεπτίδιο που πληροί τις προϋποθέσεις να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης της ανευρυσματικής νόσου. Για την επιβεβαίωση της κλινικής χρησιμότητας της RL2, απαιτούνται μελέτες στις οποίες θα περιληφθούν και ασθενείς με μικρότερα ανευρύσματα υπό παρακολούθηση, ώστε να προσδιοριστούν οι τιμές αναφοράς πάνω από τις οποίες είναι πιθανόν οι εξεταζόμενοι στον γενικό πληθυσμό να παρουσιάζουν αρτηριακό ανεύρυσμα και να οδηγούνται σε περαιτέρω εκλεκτικό απεικονιστικό έλεγχο διερεύνησης και παρεμβατική αντιμετώπιση στη βάση των υπαρχόντων ενδείξεων. Τέλος, το γεγονός ότι η RL2 ορού αυξάνεται σημαντικά σε συμπτωματικά ανευρύσματα, αποτελεί ένδειξη ότι ενδεχομένως είναι χρήσιμη στην παρακολούθηση ασθενών με μικρότερα ανευρύσματα και στον καθορισμό ποιοι από αυτούς τους ασθενείς παρουσιάζουν κίνδυνο ρήξης. Το γεγονός ότι η RL2 παρουσιάζει αρνητική συσχέτιση με την ΜΜΡ-2 σε ήπια αρτηριοσκλήρυνση (υποκατηγορία ΑΤΗ1) και θετική συσχέτιση με την eNOS σε μέτρια αρτηριοσκλήρυνση (υποκατηγορία ΑΤΗ2) υποδεικνύει ότι η RL2 έχει θετική επίδραση στην αρτηριοσκλήρυνση και τα ευρήματά μας αποτελούν ακόμη μια ένδειξη για την πιθανή θεραπευτική εφαρμογή της RL2 στην αρτηριοσκλήρυνση. Η RL2 μπορεί να σχετίζεται με τη στεφανιαία νόσο και την κλινική της βαρύτητα, όμως ο μικρός αριθμός ασθενών, δεν επιτρέπει την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. Μια μελέτη των επιπέδων ορού της RL2 σε ασθενείς με στεφανιαία νόσο, ταξινομημένων σε υποκατηγορίες ανάλογα με την κλινική βαρύτητα της νόσου (επί παραδείγματι, σταθερή στηθάγχη, ασταθή στηθάγχη και ουλή μυοκαρδίου από έμφραγμα) κατά τα πρότυπα της δικής μας μελέτης, θα μπορούσε να απαντήσει στο ερώτημα αυτό.