Ανακάλυψη πρωτεϊνών σχετικών με την παθολογία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Abstract

Cervical cancer is the fourth most common and most lethal type of cancer in women, worldwide. Profylactic vaccination and regular screening have marked a decline on incidents, however the disease still accounts for a significant number of deaths and the available therapeutic approaches affect patients’ fertility. The purpose of this doctoral dissertation is the use of proteomic techniques in combination with bioinformatics and literature mining for the discovery of novel proteins involved in cervical cancer pathology with the aim of better understanding of the molecular mechanisms underlying the malignancies formation. To approach the goal, four cell lines, representative of the most common HPV infections (HeLa - HPV 18, SiHa - HPV 16), HPV-free cervical cancer (C33A) as well as normal cervical keratinocytes (HCK1T) were used. Analysis of the protein extracts was performed based on the GeLC-MS/MS protocol and provided a satisfactory number of protein identifications (2,500-3,500 proteins per cell line) with a very good reproducibility. The differentially expressed proteins that resulted from the comparison of each cervical cancer cell line with the normal keratinocytes were ~800-1,400 per comparison, and they provide useful information on the deregulation of signaling pathways and important molecules in cervical cancer. Bioinformatics analysis of the differentially expressed proteins validated the specificity of the identifications and the accuracy of the measurements as the deregulated molecular pathways are associated with the high metabolic demands and increased cell cycle that are known to occur in cancer cells. For the shortlisting of interesting proteins for further investigation, 105 differentially expressed proteins that followed the same expression trend in the three comparisons (HeLa/HCK1T, SiHa/CK1T και C33A/HCK1T) were chosen and extensively investigated in the literature. The proteins that were not studied in the context of cervical cancer before but have data on other types of cancers with similar expression trend as in the present study, are in total 21 and constitute the basis for further investigation and experiments. In addition, after a deeper investigation, 7 of these proteins were chosen (LIM domain and actin-binding protein 1, Importin subunit alpha-1, Serum paraoxonase/arylesterase 2, Elongation factor 1-alpha 2, Caprin-1, Mitochondrial import receptor subunit TOM34, Ras GTPase-activating protein-binding protein 1) for immunohistochemistry experiments on cervical specimens from healthy participants and patients with low and high grade squamous intraepithelial lesions and cervical cancer, as a next step to the present doctoral dissertation. Furthermore, functional investigation experiments for the proteins LIM domain and actin-binding protein 1, Importin subunit alpha-1 και Ras GTPase-activating protein-binding protein have been designed. In conclusion, the results of this doctoral dissertationprovide novel knowledge on the molecular mechanisms and the key regulators of cervical carcinogenesis and can be the basis for further investigations through systems biology approaches and contribute in the discovery of biomarkers and the identification of novel therapeutic targets.

Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας αποτελεί την τέταρτη συχνότερη και πιο θανατηφόρα μορφή καρκίνου στις γυναίκες, παγκοσμίως. Ο εμβολιασμός και ο προληπτικός έλεγχος έχουν μειώσει τα περιστατικά όμως η ασθένεια ευθύνεται για σημαντικό αριθμό θανάτων ενώ η διαθέσιμες θεραπευτικές μέθοδοι επηρεάζουν τη γονιμότητα των ασθενών. Σκοπός της διδακτορικής αυτής διατριβής αποτελεί η χρήση τεχνικών πρωτεωμικής σε συνδυασμό με τη βιοπληροφορική ανάλυση και την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας για την ανακάλυψη νέων πρωτεϊνών που σχετίζονται με την παθολογία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας με στόχο την καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν το σχηματισμό των δυσπλασιών. Για την επίτευξη του στόχου, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις κυτταρικές σειρές, αντιπροσωπευτικές των συχνότερων μολύνσεων από HPV (HeLa - HPV 18, SiHa - HPV 16), του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας χωρίς μόλυνση από HPV (C33A), καθώς και φυσιολογικών κερατινοκυττάρων του τραχήλου της μήτρας (HCK1T). Η ανάλυση των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο GeLC-MS/MS και προσέφερε ικανοποιητικό αριθμό αναγνωρίσεων (2.500-3.500 πρωτεΐνες ανά κυτταρική σειρά) με πολύ καλή αναπαραγωγιμότητα. Από τη σύγκριση της κάθε κυτταρικής σειράς καρκίνου του τραχήλου της μήτρας με τη τα φυσιολογικά κερατινοκύτταρα προέκυψαν ~800-1.400 διαφορικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες, ανά σύγκριση, οι οποίες παρέχουν χρήσιμη πληροφορία για τις μεταβολές στη ρύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών και των σημαντικών μορίων στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Η βιοπληροφορική ανάλυση των διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών επιβεβαίωσε την ειδικότητα των αναγνωρίσεων και την ακρίβεια των μετρήσεων καθώς τα μοριακά μονοπάτια που εμφάνισαν αλλαγή στη ρύθμισή τους σχετίζονται με τις υψηλές ενεργειακές ανάγκες και τον αυξημένο κυτταρικό κύκλο που είναι γνωστό ότι υφίστανται στα καρκινικά κύτταρα. Για τη διαλογή πρωτεϊνών ενδιαφέροντος για περαιτέρω διερεύνηση επιλέχθηκαν οι 105 διαφορικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες που εμφάνισαν κοινή τάση έκφρασης στις τρεις συγκρίσεις (HeLa/HCK1T, SiHa/CK1T και C33A/HCK1T) και μελετήθηκαν ενδελεχώς στη βιβλιογραφία. Οι πρωτεΐνες που δεν είχαν μελετηθεί προηγουμένως στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας αλλά υπάρχουν δεδομένα για αυτές σε άλλους τύπους καρκίνων με παρόμοια τάση έκφρασης όπως και στην παρούσα μελέτη, είναι συνολικά 21 και αποτελούν τη βάση για περαιτέρω μελέτη και πειράματα. Μάλιστα, μετά από βαθύτερη διερεύνηση, επιλέχθηκαν 7 από αυτές (LIM domain and actin-binding protein 1, Importin subunit alpha-1, Serum paraoxonase/arylesterase 2, Elongation factor 1-alpha 2, Caprin-1, Mitochondrial import receptor subunit TOM34, Ras GTPase-activating protein-binding protein 1) για πειράματα ανοσοϊστοχημείας σε δείγματα τραχήλου από υγιείς και ασθενείς με προκαρκινική δυσπλασία χαμηλής και υψηλής διαφοροποίησης καθώς και με και καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, ως συνέχεια της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Ακόμη, για τις πρωτεΐνες LIM domain and actin-binding protein 1, Importin subunit alpha-1 και Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 έχουν σχεδιαστεί και πειράματα λειτουργικής διερεύνησης. Eν κατακλείδι, αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής παρέχουν νέες γνώσεις για τους μοριακούς μηχανισμούς και τους βασικούς ρυθμιστές της καρκινογένεσης του τραχήλου της μήτρας και μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για περαιτέρω έρευνες και προσεγγίσεις της βιολογίας συστημάτων και να συμβάλουν στην ανακάλυψη βιοδεικτών και στην αναγνώριση νέων φαρμακευτικών στόχων.