Εφαρµογή βιοχηµικών και ανοσοχηµικών τεχνικών για τη µελέτη πρωτεϊνών που εµπλέκονται σε κυτταρικούς µηχανισµούς σηµατοδότησης (υποδοχέας ρυανοδίνης τύπου 2, καλµοδουλίνη)

Abstract

Calmodulin (CaM) is an important regulator (inhibitor) of the cardiac ryanodine receptortype-2 (RyR2) function as a calcium release channel of SR, playing a pivotal role inex citation-contraction coupling. Although the mechanism of CaM/RyR2 interaction is not fully understood, it is widely accepted that the main CaM binding domain is located with inresidues 3583–3603 of RyR2, while a series of data suggest that additional regions inRyR2 can act as potential CaM binding domains. On the other hand, a number of Ca Mmutants, with possibly impaired RyR2-regulatory capacity, have been recently characterized in patients with heart dysfunction. The goal of the present thesis was to study the mechanism of the interaction between wild type CaM (CaMWT) and RyR2 as well as to study the interaction between certain CaM mutants and RyR2. In order to study the CaMWT/RyR2 interaction, eight peptide fragments of RyR2 and derivatives there of were synthesized. Potential binding of the above synthetic peptides to CaMWT was studied by means of pull-down, ELISA-type and isothermal titration calorimetry experiments. Moreover, some of the RyR2-peptides were used as antigens for the development of polyclonal antibodies, while anti-peptide polyclonal antibodies for full-length CaMWT were also developed and used in the ELISA-type experiments. According to the result sobtained, the C-terminus of RyR2 seems to contain an additional CaMWT binding domain(4255-4277). For studying the interaction between CaM mutants and RyR2, six CaM mutants were produced and heavy SR vehicles from pig hearts (as a source of RyR2)were prepared. Consequently, the effect of the CaM mutants on the RyR2 activity was tested, in comparison with CaMWT, with the [3H] ryanodine binding assay, while binding of the CaM mutants to RyR2 was also evaluated, in comparison with CaMWT too, with pull down experiments. As revealed by the results obtained, specific CaM mutations (N54I,F90L, D96V, D130G) affect both, binding capacity to RyR2 and the channel activity. Further exploitation of the molecular tools and the techniques developed in the frame work of this thesis will help us better understand and elucidate the mechanisms underlying cardiac function.

Η καλµοδουλίνη (CaM) αποτελεί σηµαντικό ρυθµιστή (αναστολέα) του καρδιακού υποδοχέα ρυανοδίνης τύπου-2 (RyR2) που δρα ως δίαυλος απελευθέρωσης Ca2+ από το ΣΔ, διαδραµατίζοντας κύριο ρόλο στον µηχανισµό της σύζευξης διέγερσης-συστολής. Παρόλο που ο µηχανισµός αλληλεπίδρασης CaM/RyR2 δεν είναι πλήρως γνωστός, είναι κοινώς αποδεκτό ότι η κύρια περιοχή πρόσδεσης της CaM στον RyR2 αντιστοιχεί στην αµινοξική αλληλουχία 3583-3603, ενώ σειρά δεδοµένων υποδεικνύει τη συµµετοχή και άλλων περιοχών του RyR2 στην πρόσδεση της CaM. Από την άλλη πλευρά, µεταλλαγµένες µορφές της CaM, µε πιθανόν πληµµελή ικανότητα ρύθµισης του RyR2, εντοπίστηκαν πρόσφατα σε ασθενείς µε καρδιακή δυσλειτουργία. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν αφενός η µελέτη του µηχανισµού αλληλεπίδρασης της αγρίου τύπου CaM(CaMWT) µε τον RyR2 και αφετέρου η µελέτη της αλληλεπίδρασης µεταλλαγµένων µορφών της CaM µε τον RyR2. Για τη µελέτη της αλληλεπίδρασης CaMWT/RyR2 έγινε σύνθεση οκτώ πεπτιδικών τµηµάτων του RyR2 καθώς και παραγώγων τους. Τα πεπτίδια αξιοποιήθηκαν κυρίως στη µελέτη πιθανής αλληλεπίδρασης µε την CaMWT, µε πειράµατα συγκατακρήµνισης, τύπου ELISA και θερµιδοµετρίας ισόθερµης τιτλοδότησης. Ορισµένα RyR2-πεπτίδια αξιοποιήθηκαν επίσης ως αντιγόνα για την ανάπτυξη πολυκλωνικών αντισωµάτων, ενώ αναπτύχθηκαν και αντι-πεπτιδικά αντισώµατα ικανά να αναγνωρίζουν την CaMWT, που χρησιµοποιήθηκαν στα πειράµατα τύπου ELISA. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα, τo C-τελικό άκρο του RyR2 είναι πιθανόν να περιέχει µία επιπλέον περιοχή πρόσδεσης της CaMWT (4255-4277). Για τη µελέτη της αλληλεπίδρασης µεταλλαγµένων µορφών της CaM µε τον RyR2 έγινε παραγωγή έξι µεταλλαγµένων µορφών της CaM καθώς και παρασκευή βαρέων κυστιδίων-φορέων ΣΔ από καρδιές χοίρων (ως πηγήςRyR2). Στη συνέχεια, µελετήθηκε, σε σχέση µε την CaMWT, τόσο η επίδραση των µεταλλαγµένων µορφών της CaM στη λειτουργικότητα του RyR2, µε πειράµατα πρόσδεσης [3Η] ρυανοδίνης στον RyR2, όσο και η ικανότητα πρόσδεσής τους στον RyR2, µε πειράµατα συγκατακρήµνισης. Όπως προέκυψε, συγκεκριµένες µεταλλάξεις της CaM(N54I, F90L, D96V, D130G) επηρεάζουν την ικανότητα πρόσδεσης στον RyR2 και, ταυτόχρονα, τη λειτουργικότητα του υποδοχέα. Περαιτέρω αξιοποίηση των µοριακών εργαλείων και των τεχνικών, που αναπτύχθηκαν στην παρούσα διατριβή, θα βοηθήσει στην καλύτερη κατανόηση των µηχανισµών που διέπουν την καρδιακή λειτουργία.