Ένζυμα σε ιοντικούς διαλύτες τρίτης γενιάς: μελέτη της δομής και λειτουργίας τους - εφαρμογή στην ανάπτυξη πράσινων βιοδιεργασιών

Abstract

The aim of this study is to invstigate the effect of neoteric non conventional media such as 3rd generation ionic liquids and deep eutectic solvents on the catalytic behavior of oxidoreductases and hydrolases, leading to the development of novel environmental friendly biocatalytic systems. The scientific interest for these non conventional media renders from the increased needs for environmental friendly technologies in industry. The effect of 3rd generation hydroxyethylammonium ionic liquids (ILs) on the biocatalytic behavior and structure of solubilized enzymes was investigated using cytochrome c (cyt c) as a model protein. The use of IL-based media enhances the tolerance of cyt c against the denaturing effect of H2O2 and increases (up to 20 fold) its catalytic efficiency compared to that observed in buffer. This beneficial effect strongly correlates with the concentration of ILs used, as well as the chaotropicity of their cations. UV–vis, circular dichroism and Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopic studies indicated that, the effect of ILs on the catalytic behavior of cyt c could be correlated with slight structural changes on the protein molecule and/or perturbations of the heme microenvironment. The use of hydroxylethylammonium-based ILs as reaction media increased (up to 4-fold) the decolorization activity of cyt c. All ILs used were recycled and successfully reused up to three times. The catalytic behavior of cyt c was further investigated in the presence of various choline chloride (ChCl) and ethylammonium chloride (EAC) based deep eutectic solvents (DES), formed with three biodegradable hydrogen bond donors (urea, glycerol, and ethylene glycol). The peroxidase activity of biocatalyst strongly depends on the nature of the ammonium salt and hydrogen bond donor used for the formation of DES, as well as on DES concentration in the reaction media. UV−vis and circular dichroism spectroscopic studies indicate that the effect of DES on the biocatalytic behavior of cyt c is correlated with heme microenvironment perturbations. Moreover, EAC based DES stabilize cyt c, enhance its activity for the biodegradation of an industrial dye and are successfully reused up to four times. Εnzyme-inorganic hybrid nanoflowers using copper (II) ions as the inorganic component and lipase B from Candida antarctica as the organic component were prepared. Various x hydroxyethylammonium ILs and DES were tested as media for hydrolytic and synthetic reactions catalysed by lipase-inorganic hybrid nanoflowers. The nature of ionic solvents used has a significant effect on the hydrolytic and synthetic activity of the immobilized lipase, as well as on its stability and reusability. DES have been proved to be better solvents than most hydroxylethylammonium-based ILs for esterification or hydrolytic reactions catalysed by lipase-nanoflowers. The use of DES as reaction media significantly enhances the thermal stability of the immobilized enzyme compared to that observed in buffer. Moreover, lipase-nanoflowers could be efficiently reused up to seven times in DES. Finally, the effect of various hydroxyethylammonium ILs and DES on the catalytic behavior of tyrosinase from Agaricus bisporus (free or immobilized) was investigated. The immobilized preparation has been proved to be better biocatalyst with enhanced biocatalytic activity in the presence of these media compared with the free enzyme. The activity of the enzyme significantly depends on the nature of the IL or DES in the reaction media. The stability of the immobilized tyrosinase is improved in the presence of most of the ILs and DES tested. Fluorescence spectroscopy was employed in order to investigate conformational changes of the protein in the presence of these solvents. It was found that structural modifications imposed by ILs and DES strongly depend on the nature of the solvent tested. ILs and DES were successfully used as media for the enzymatic synthesis of hydroxytyrosol as well as for the phenol removal in continuous flow bioreactor.

Στόχο της παρούσας διατριβής αποτελεί η μελέτη της επίδρασης νέων μη συμβατικών μέσων όπως είναι τα ιοντικά υγρά 3ης γενιάς και οι βαθείς ευτηκτικοί διαλύτες στην καταλυτική συμπεριφορά οξειδοαναγωγικών και υδρολυτικών ενζύμων με απώτερο σκοπό την ανάπτυξη περιβαλλοντικά φιλικών βιοκαταλυτικών διεργασιών. Το αυξημένο ερευνητικό ενδιαφέρον για αυτή την κατηγορία μη συμβατικών μέσων, εντάσσεται στην διαρκώς αυξανόμενη ανάγκη εισαγωγής περιβαλλοντικά φιλικών διεργασιών σε βιομηχανικές διεργασίες. Υδροξυαιθυλαμμωνικά ιοντικά υγρά 3ης γενιάς, χρησιμοποιήθηκαν για την μελέτη της επίδρασης της παρουσίας τους στα καταλυτικά και δομικά χαρακτηριστικά του κυτοχρώματος c. Η παρουσία αυτών των διαλυτών στο μέσο της αντίδρασης αύξησε την καταλυτική δραστικότητα του κυτοχρώματος c (έως 20 φορές), αλλά και την σταθερότητά του απέναντι σε αποδιατακτικούς παράγοντες (Η2Ο2) συγκριτικά με το υδατικό διάλυμα. Η θετική επίδραση αυτών των μέσων εξαρτάται σημαντικά από την συγκέντρωσή τους στο μίγμα της αντίδρασης καθώς επίσης και την χαοτροπικότητα του κατιόντος. Φασματοσκοπικές μελέτες ορατού υπεριώδους, κυκλικού διχρωισμού και υπερύθρου υγρών δειγμάτων έδειξαν ότι η επίδραση των ιοντικών υγρών συνδέεται με μικρές αλλαγές στην δομή του πρωτεϊνικού μορίου ή/και αλλαγές στο μικροπεριβάλλον της αίμης. Η εφαρμογή των ιοντικών υγρών ως μέσα για την πραγματοποίση αντιδράσεων αποχρωματισμού οδήγησαν σε αύξηση της δραστικότητας του κυτοχρώματος έως και 4 φορές συγκριτικά με το υδατικό διάλυμα. Όλα τα ιοντικά υγρά που μελετήθηκαν επαναχρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς έως και τέσσερις φορές. Η καταλυτική συμπεριφορά του κυτοχρώματος c μελετήθηκε περαιτέρω παρουσία βεθέων ευτηκτικών διαλυτών (DES) με οργανικά άλατα το χλωρίδιο της χολίνης (ChCl) και το χλωρίδιο του αιθυλαμμωνίου (ΕΑC) και δότες δεσμών υδρογόνου την ουρία (U), την γλυκερόλη (Gly) και την αιθυλενική γλυκόλη (EG). Η δραστικότητα του κυτοχρώματος c εξαρτάται σημαντικά, από την φύση του αμμωνιακού άλατος και του δότη δεσμών υδρογόνου του εκάστοτε DES καθώς επίσης και από την συγκέντρωσή του στο μίγμα της αντίδρασης. Η επίδραση των DES στην δραστικότητα του κυτοχρώματος συνδέεται με αλλαγές στο μικροπεριβάλλον της αίμης. Επιπλέον, τα DES με βάση το EAC σταθεροποιούν το πρωτεϊνικό μόριο και αυξάνουν την δραστικότητά αποχρωματισμού του, ενώ παράλληλα μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν έως και τέσσερις φορές. Εν συνεχεία, παρασκευάστηκαν υβριδικά σκευάσματα νανοϋλικών αποτελούμενα από ιόντα χαλκού και λιπάση B από Candida antarctica γνωστά με το όρο «nanoflowers». Η δραστικότητα αυτών των σκευασμάτων μελετήθηκε σε διάφορα υδροξυαιθυλαμμωνικά ιοντικά υγρά 3ης γενιάς και DES. Η φύση των ιοντικών διαλυτών (ιοντικά υγρά και DES) επιδρά σημαντικά στην υδρολυτική και συνθετική δραστικότητα της ακινητοποιημένης λιπάσης καθώς επίσης και στην σταθερότητα και επαναχρησιμοποίηση της. Στα DES με βάση το ChCl η δραστικότητα αλλά κυρίως η σταθερότητα του ενζύμου αυξάνεται σημαντικά, συγκριτικά με το υδατικό διάλυμα. Η επαναχρησιμοποίηση των CALBnanoflowers σε DES μπορεί να πραγματοποιηθεί αποτελεσματικά για 7 βιοκαταλυτικούς κύκλους διατηρώντας το 50 % της αρχικής τους δραστικότητας. Τελος, η μελέτη της επίδρασης ιοντικών διαλυτών (ιοντικών υγρών και DES) στην καταλυτική συμπεριφορά της τυροσινάσης από μανιτάρια Agaricus bisporus τόσο σε ελεύθερη μορφή όσο και ακινητοποιημένη (CLEAs) έδειξε ότι το ακινητοποιημένο ένζυμο παρουσίασε αυξημένη δραστικότητα παρουσία των ιοντικών υγρών και DES συγκριτικά με το ελεύθερο σκεύασμα. Η δραστικότητα του ενζύμου εξαρτάται σημαντικά από την φύση του εκάστοτε διαλύτη στο μίγμα της αντίδρασης. Η παρουσία τόσο των ιοντικών υγρών όσο και των DES σταθεροποιεί σημαντικά το ένζυμο μετά από 24 ώρες επώασης στους 40 οC. Οι διαμορφωτικές αλλαγές της πρωτεΐνης παρουσία των ιοντικών διαλυτών μελετήθηκαν μέσω της φασματοσκοπίας φθορισμού. Ο φθορισμός της πρωτεΐνης, και ως εκ τούτου τα δομικά χαρακτηριστικά, φαίνεται να επηρεάζονται σημαντικά από την φύση και την συγκέντρωση του εκάστοτε μέσου στο διάλυμα μέτρησης. Τόσο τα ιοντικά υγρά όσο και τα DES χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς ως μέσα, για την πραγματοποίηση αντιδράσεων σύνθεσης της υδροξυτυροσόλης οδηγώντας σε υψηλές αποδόσεις την αντίδραση (έως 85 %) καθώς επίσης και για την αποδόμηση της φαινόλης από την ακινητοποιημένη τυροσινάση σε συνεχούς λειτουργίας μικρο-βιοαντιδραστήρα φτάνοντας το ποσοστό αποδόμησης 95 %.