Μελέτη του λειτουργικού ρόλου της πρωτεΐνης Set κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια του οργανισμού-μοντέλου Danio rerio (zebrafish)

Abstract

SET oncoprotein is an evolutionarily conserved protein that is widely expressed in all cell types and tissues. It is a multifunctional protein implicated in diverse cellular processes including chromatin remodelling, gene expression, cell cycle regulation, apoptosis and migration. SET is a potent inhibitor of the protein phosphatase 2A (PP2A). It has also been shown that SET is involved in the development of Alzheimer’s disease as well as of various types of cancer, which has led to new studies towards its use as a target in cancer treatment. The aim of this work was to understand the physiological roles of SET at the organismal level focusing on the zebrafish orthologs, Seta and Setb. Seta/b proteins share high homology with their human counterpart. In situ hybridization revealed similar expression patterns for seta and setb genes. Both transcripts distributed at the midbrain-hindbrain boundary, the retinal pigment epithelium, the ganglion cell layer and the ciliary marginal zone, as well as, the sensory hair cells of the otic vesicle and the lateral line neuromasts. Similar results were obtained after whole mount immunofluorescence experiments. Taken together, these data provide a first link between the expression profiles of these genes and the development of the sensory organs of zebrafish. Loss-of-function studies using antisense morpholino oligonucleotides targeting both seta /b genes (MOab), resulted in increased apoptosis, reduced cell proliferation and morphological defects. The morphant phenotypes were partially rescued when MOab was co-injected with the human SET mRNA. Similar phenotypic defects were observed upon knockdown of setb with a transcription-blocking morpholino (MOb) or by CRISPR/Cas9. Moreover, in vivo labeling of hair cells using the fluorescent dye FM1-43, showed a decreased number of active neuromasts in MOab-, MOb- and gRNA/Cas9-injected embryos. The effects of the pharmacological inhibition of Seta/b with the sphingosine analog FTY720 were in accordance with the previous data, further supporting the functional correlation of Seta/b with these mechanoreceptive organs. In line with this, increased apoptosis was also detected in the hair cells of the neuromasts and otic vesicle upon seta/b knockdown or drug-mediated inhibition. Microarray analysis of the MOab transcriptome revealed differential expression in networks controlling gene transcription in the sensory organs. Collectively, the present work provides new insights on the physiological roles of seta and setb genes and shows for the first time that their functions are essential for embryonic and sensory system development.

Η ογκοπρωτεΐνη SET είναι μια εξελικτικά συντηρημένη πρωτεΐνη η οποία εκφράζεται σε όλους τους ιστούς και τους τύπους κυττάρων. Είναι πολυλειτουργική, με ρόλο στην αναδιοργάνωση της χρωματίνης, στη γονιδιακή έκφραση, στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, στην απόπτωση και στην κυτταρική μετανάστευση. Χαρακτηριστική είναι η δράση της ως αναστολέας της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2A (ΡΡ2Α). Επιπλέον, εμπλέκεται στην ανάπτυξη της νόσου Alzheimer όπως και διαφόρων τύπων καρκίνου, γεγονός που έχει πυροδοτήσει μελέτες για την αξιοποίησή της ως μόριο- στόχο στη θεραπεία αυτών των ασθενειών. Σκοπός της εργασίας ήταν η διερεύνηση του φυσιολογικού ρόλου της SET σε επίπεδο οργανισμού. Συγκεκριμένα, αξιοποιήθηκε το zebrafish όπου εκφράζονται δύο παράλογες πρωτεΐνες, οι Seta και Setb. Οι Seta/b παρουσιάζουν εξαιρετικά υψηλό ποσοστό ομολογίας τόσο μεταξύ τους όσο και με την ανθρώπινη ορθόλογη. Η ανάλυση του προτύπου έκφρασης των seta/b έδειξε ότι τα μετάγραφα κατανέμονται στο όριο μεσεγκεφάλου-οπίσθιου εγκεφάλου, στο μελάχρουν επιθήλιο του αμφιβληστροειδούς, στη στιβάδα των γαγγλιακών κυττάρων και την ακτινωτή οριακή ζώνη των οφθαλμών, στις αισθητήριες δομές του αυτιού και στους νευρομαστούς της πλευρικής γραμμής. Όμοια αποτελέσματα προήλθαν από πειράματα ανοσοφθορισμού αναδεικνύοντας την έκφραση των γονιδίων set στα αισθητήρια όργανα του zebrafish. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των γονιδίων έγινε μέσω πειραμάτων καταστολής έκφρασης. Η στόχευση των δύο γονιδίων seta/b μέσω χρήσης ειδικού αντινοηματικού ολιγομερούς (morpholino MOab), προκάλεσε αύξηση της απόπτωσης, μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και οδήγησε στην ανάπτυξη μορφολογικών αλλαγών. Μέσω συνδυαστικής έγχυσης ΜΟab και mRNA του ανθρώπινου γονιδίου SET επετεύχθη μερική ανάκτηση του φαινοτύπου. Αντίστοιχες παρατηρήσεις προήλθαν τόσο από τη χρήση ενός αντινοηματικού ολιγομερούς με διαφορετικό μηχανισμό δράσης (morpholino ΜΟb) όσο και μέσω του συστήματος CRISPR-Cas9. Επιπλέον, η μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών Seta/b οδήγησε σε μείωση του αριθμού των ενεργών νευρομαστών, όπως διαπιστώθηκε έπειτα από in vivo χρώση των morphants με τη φθορίζουσα ουσία FM1-43. Στο ίδιο αποτέλεσμα οδήγησε η καταστολή του setb μέσω έγχυσης του ΜΟb ή του gRNA/Cas9. Η παραπάνω παρατήρηση επιβεβαιώθηκε και μέσω φαρμακολογικής αναστολής των Seta/b, έπειτα από έκθεση των εμβρύων στο φάρμακο FTY720. Συνδυαστικά, μέσω εναλλακτικών μεθόδων, αποδείχθηκε η λειτουργική συσχέτιση των Seta/b με τα κροσσωτά κύτταρα των νευρομαστών. H ανάλυση του προτύπου γονιδιακής έκφρασης των morphants ανέδειξε την ύπαρξη διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων τα οποία, μέσω ρύθμισης της μεταγραφής, επηρεάζουν τη διαφοροποίηση και την ανάπτυξη των οργάνων του αισθητήριου συστήματος. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη συγκεκριμένη εργασία, συνδέουν για πρώτη φορά την δράση των γονιδίων seta και setb με την εμβρυογένεση και την ανάπτυξη των οργάνων του αισθητήριου συστήματος.