Ο ρόλος του εναλλακτικού μονοπατιού του NF-κB στο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Abstract

The NF-κB family of transcription factors is of paramount importance in cancer. Although, during the last years, research has focused on the classical pathway of NF-ΚB, little is known of the possible role of the alternative pathway, which has just recently been associated with carcinogenesis and solid tumor growth. Notably, the information available on its role in non-small cell lung cancer (NSCLC) is very limited. The aim of the present study was to evaluate the expression of NF-κB2, RELB, NIK and BCL3 (at the mRNA and protein level) in NSCLC and to investigate its association with clinicopathological parameters and overall survival outcome. Furthermore, the clinical significance of 3 NF-κB2 single nucleotide polymorphisms (SNPs) (rs7897947, rs11574852 and rs12769316) and one BCL3 SNP (rs8100239) in NSCLC patients was evaluated. For this purpose, DNA was extracted from 268 blood specimens and paraffin-embedded tissue specimens (adjacent to tumor, non-neoplastic) from patients with NSCLC and 279 blood specimens from healthy donors. Samples were genotyped for the above SNPs using real-time PCR. In a subgroup of the cohort of patients, protein and mRNA expression levels of NF-κB2, RELB, ΝΙΚ and BCL3 were evaluated by immunohistochemistry and quantitative RT-PCR, respectively. The main results of the study can be summarized as follows:1)Protein expression-NF-κB2, RELB, BCL3 and NIK proteins are overexpressed in cancer cells compared to normal adjacent tissues (P<0.001 for all molecules). -NF-κB2, RELB and BCL3 protein expression correlates with the disease stage (P=0.03, P=0.016 and P=0.045, respectively). -Immunopositivity for NF-κB2 and BCL3 correlates with grade (P=0.046 and P=0.002, respectively)-There is a correlation between histological subtype and RELB, NIK and BCL3 protein expression (P=0.008, P=0.002 and P=0.031, respectively). -Lymph node infiltration is associated with NF-κB2 and ΝΙΚ protein expression (P=0.044 και P=0.021).-Two-year survival of patients with NSCLC was related to cytoplasmic expression of RELB (P=0.031). -NF-κB2 protein levels are correlated with RELB protein levels (P=0.029 and P=0.004, respectively).-Smaller in diameter tumors have increased nuclear immunopositivity for BCL3 (P=0.042).-Local relapse rate is correlated with BCL3 and NIK protein expression (P=0.05 and P=0.029)-Cytoplasmic NIK levels are associated with tumor primary site (p=0.032) as well as with BCL3 protein expression levels (p=0.012).2)Gene expression-RELB mRNA levels are elevated in cancer cells compared with normal (P=0.009), while such a difference was not noted for NF-κB2, ΝΙΚ and BCL3. -mRNA expression of NF-κB2, RELB and BCL3 is associated with the histological subtype (P=0.031, P=0.022 and P=0.021, respectively) and maximum diameter of the tumor (P=0.046, P=0.028 and P=0.026, respectively). NF-κB2 mRNA levels are related to grade (P=0.016), while RELB mRNA levels are associated with relapse rates (P=0.005).3)Single nucleotide polymorphisms-Rs12769316 SNP (NF-κB2) was found to be associated with NSCLC risk and patients’ survival. In particular, genotype AA (rs12769316G>A) was correlated with NSCLC risk (P=0.003), while a trend was observed between allele A (rs12769316) carriage and three-year survival of stage I patients (P=0.057). On the contrary, stage II homozygotes GG (rs12769316) had poorer survival compared to A allele carriers (P=0.012). In addition, rs12769316 was correlated with NF-κB2 protein expression (P=0.001), disease stage (P=0.042) and with the maximum diameter of tumors (P=0.025).-Allele distribution of the NF-κB2 SNP rs7897947 differs between patients and healthy donors (P=0.024) and is related to disease stage and tumor size (P=0.016 και P=0.04 respectively). - The NF-κB2 SNP rs11574852 was associated with relapse rate (P=0.045), histological subtype, grade, 2-year survival (P=0.036, P=0.004 and P=0.05 respectively) and NF-κB2 protein expression (P<0.001).- The BCL3 SNP rs8100239 was associated with 2-year survival regardless of disease stage (P=0.009). Conclusively, the above findings support the deregulation of the alternative pathway of NF-κB in NSCLC, implicating this signalling pathway in carcinogenesis and tumor growth. Furthermore, it seems that genetic markers of this pathway are associated with NSCLC, though more studies are needed to elucidate their role and significance.

Μία από τις πλέον σημαντικές και μελετημένες οικογένειες μεταγραφικών παραγόντων στον καρκίνο είναι αυτή του NF-κB. Αν και το κλασικό μονοπάτι του NF-κB έχει γίνει αντικείμενο εντατικής έρευνας από δεκαετιών, το εναλλακτικό μονοπάτι μόλις πρόσφατα συσχετίσθηκε με την καρκινογένεση, ενώ ελάχιστα δεδομένα υπάρχουν για τον ρόλο του στο μη-μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα (ΜΜΚΠ). Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός της έκφρασης των μορίων NF-κB2, RELB, NIK και BCL3 σε επίπεδο πρωτεΐνης και mRNA και η συσχέτιση της με τα κλινικοπαθολογοανατομικά δεδομένα και την επιβίωση ασθενών με ΜΜΚΠ. Επίσης, εκτιμήθηκε η κλινική σημασία των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών rs7897947, rs11574852, rs12769316 του γονιδίου NF-κB2 και rs8100239 του γονιδίου BCL3 στον ΜΜΚΠ. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν 268 δείγματα αίματος και δείγματα μονιμοποιημένων σε παραφίνη ιστών (παρακείμενων στην εξεργασία, μη νεοπλασματικών) ασθενών με ΜΜΚΠ και 279 δείγματα αίματος υγιών δοτών από τα οποία απομονώθηκε DNA με τη χρήση ολοκληρωμένων συστημάτων αντιδραστηρίων. Η παρουσία των 4 πολυμορφισμών ανιχνεύτηκε με τη χρήση πραγματικού χρόνου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (real-time PCR). Η έκφραση των μορίων NF-κB2, RELB, ΝΙΚ και BCL3 σε επίπεδο πρωτεΐνης και mRNA προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους και με τη χρήση real-time RT-PCR, αντιστοίχως. Τα κύρια αποτελέσματα της μελέτης μπορούν να συνοψισθούν ως εξής:1)Όσον αφορά την πρωτεϊνική έκφραση:-Τα μόρια NF-κB2, RELB, BCL3 και NIK υπερεκφράζονται στα καρκινικά κύτταρα σε σχέση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό (P<0,001 για όλα τα μόρια). -H έκφραση των μορίων NF-κB2, RELB και BCL3 σχετίζεται με το στάδιο της νόσου (P=0,03, P=0,016, και P=0,045 αντιστοίχως). -Η ανοσοθετικότητα για τα μόρια NF-κB2 και BCL3 συνδέεται με το βαθμό διαφοροποίησης (P=0,046 και P=0,002, αντιστοίχως).-Ο ιστολογικός τύπος συσχετίζεται με την έκφραση των RELB, NIK και BCL3 (P=0,008, P=0,002 και P=0,031). -Μεταξύ της έκφρασης των NF-κB2 και ΝΙΚ και της διηθήσεως των επιχώριων λεμφαδένων παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση (P=0,044 και P=0,021).-Η διετής επιβίωση των ασθενών με ΜΜΚΠ σχετίστηκε με την κυτταροπλασματική εντόπιση του RELB (P=0,031)-Τα επίπεδα έκφρασης του NF-κB2 σχετίζονται με εκείνα του RELB (P=0,029 και P=0,004, αντιστοίχως).-Οι μικρότεροι σε μέγεθος όγκοι παρουσιάζουν αυξημένη πυρηνική ανοσοαντίδραση για τον BCL3 (P=0,042).-Η συχνότητα τοπικής υποτροπής συνδέεται με την έκφραση τόσο του BCL3 όσο και του ΝΙΚ (P=0,05 και P=0,029).-Η κυτταροπλασματική έκφραση του NIK σχετίζεται με την πρωτοπαθή εντόπιση (P=0,032) και με τα επίπεδα έκφρασης του BCL3 (P=0,012).2)Όσον αφορά την γονιδιακή έκφραση:-Τα επίπεδα mRNA του RELB αυξάνουν στα καρκινικά κύτταρα σε σχέση με τα αντίστοιχα παρακείμενα του όγκου μη νεοπλασματικά (P=0,009), ενώ καμία διαφορά δεν παρατηρήθηκε για εκείνα των NF-κB2, του ΝΙΚ και του BCL3. -Η γονιδιακή έκφραση των NF-κB2, RELB και BCL3 σχετίζεται με τον ιστολογικό τύπο (P=0,031, P=0,022 και P=0,021, αντιστοίχως) και τη μέγιστη διάμετρο του όγκου (P=0,046, P=0,028 και P=0,026, αντιστοίχως). -Τα επίπεδα mRNA του NF-κB2 συνδέονται με το βαθμό διαφοροποίησης (P=0,016), ενώ η έκφραση του RELB σχετίζεται με τη συχνότητα υποτροπής (P=0,005).3)Όσον αφορά τους πολυμορφισμούς:-Η πολυμορφική θέση rs12769316 του γονιδίου NF-κB2 βρέθηκε να σχετίζεται με στατιστικά σημαντικό τρόπο με τον κίνδυνο ανάπτυξης ΜΜΚΠ και με την επιβίωση των ασθενών με ΜΜΚΠ. Ειδικότερα, ο γονότυπος AA (rs12769316G>A) συσχετίσθηκε με τον κίνδυνο ανάπτυξης ΜΜΚΠ (P=0,003), ενώ ασθενείς σταδίου Ι φορείς του αλληλομόρφου A (rs12769316) εμφάνισαν καλύτερη τριετή επιβίωση χωρίς όμως αυτή η τάση να φτάσει το όριο στατιστικής σημαντικότητας (P=0,057). Αντιθέτως, οι ομοζυγώτες GG (rs12769316) του σταδίου ΙΙ παρουσίασαν χειρότερη πενταετή επιβίωση σε σύγκριση με τους φορείς του αλληλομόρφου A (P=0,012). Επίσης, ο πολυμορφισμός rs12769316 σχετίσθηκε με την πρωτεϊνική έκφραση του NF-κB2 (P=0,001), με το στάδιο της νόσου (P=0,042) και με τη μέγιστη διάμετρο του όγκου (P=0,025).-Η κατανομή των αλληλομόρφων του πολυμορφισμού rs7897947 (NF-κB2) διαφέρει μεταξύ των ασθενών και των υγιών (P=0,024) και σχετίζεται με το στάδιο της νόσου και το μέγεθος του όγκου (P=0,016 και P=0,04 αντιστοίχως).-Ο πολυμορφισμός rs11574852 (NF-κB2) σχετίζεται με τη συχνότητα υποτροπής της νόσου (P=0,045), με τον ιστολογικό υπότυπο, το βαθμό διαφοροποίησης, τη διετή επιβίωση (P=0,036, P=0,004, P=0,05 και αντιστοίχως) και με την πρωτεϊνική έκφραση του NF-κB2 (P<0,001).-Ο πολυμορφισμός rs8100239 του BCL3 σχετίζεται με την διετή επιβίωση ανεξάρτητα από το στάδιο της νόσου (P=0,009). Συμπερασματικά, τα ανωτέρω ευρήματα συνηγορούν υπέρ της απορρύθμισης του εναλλακτικού μονοπατιού του NF-κB στο ΜΜΚΠ, εμπλέκοντας το ανωτέρω σηματοδοτικό μονοπάτι στην καρκινογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου. Επίσης, γενετικοί δείκτες των μορίων του εν λόγω μονοπατιού φαίνεται να σχετίζονται με το ΜΜΚΠ, ωστόσο, περισσότερες μελέτες είναι αναγκαίες για την αποσαφήνιση του ρόλου και της σημασίας τους.