Μελέτη της ύπαρξης κυκλοφορούντων νεοπλασματικών κυττάρων και νεοπλασματικών κυττάρων με βλαστικό φαινότυπο και φαινότυπο επιθηλιακής μεσεγχυματικής μετατροπής σε μυελό οστών και περιφερικό αίμα ασθενών με ΚΑΠΕ και συμπαγείς όγκους: συσχέτιση με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και έκβαση

Abstract

About 3% of all cancer patients suffer from Cancer of Unknown Primary Origin(CUP). These patients present with metastatic disease for which a primary site can notbe detected at the time of diagnosis. Sophisticated diagnostic technics and operationalprocedures have failed to improve the diagnostic efficacy in this group of patients.Consequently, it has been adopted today that a policy of a limited diagnostic procedurewith basic laboratory tests and imaging studies is sufficient for the diagnosis of thissyndrome, while the use of immunohistochemistry as well as serum tumor markers ofhigh specificity may help to identify other tumors.What is still missing today is the knowledge of the underling molecular biology ofthese highly metastatic malignancies that are characterized by early aquisition of ametastatic phenotype.Since the exact mechanism of metastases formation has not yet been elucidated,there is a great need for a more extensive study of the metastatic process. Numerousstudies in cancer cell lines and animal models have demonstrated the complexity of themetastatic process. The main stages of metastasis development include the proliferationof cancer cells in the primary site, invasion in surrounding tissues and intravasation intothe circulation, where they can migrate either as single cells or clusters. Afterwards,cancer cells can extravasaste at distant sites and invade new organs to formmicrometastases, where their subsequent proliferation leads to the formation of overtmetastases. These cells, identified either as disseminated tumor cells (DTCs) insecondary sites or as circulating tumor cells (CTCs) in the peripheral blood of patients,consist the population of micrometastatic cells.Several studies have shown that the detection of CTCs in peripheral blood ofpatients with CUP is a strong and independent marker for increased risk of relapse andreduced overall survival. Moreover, the presence of CTCs in breast cancer has beenstrongly correlated with lower response rates to conventional chemotherapies.However, CTCs are a highly heterogeneous population exhibiting differentialmetastatic potential, therefore their further molecular and phenotypic characterizationis of outmost importance. This could highlight those characteristics that prospermetastatic process, contributing to a better understanding of the mechanism ofmetastasis. Moreover, CTCs are considered as a real time liquid biopsy, which allows the molecular characterization of the tumor at different time points. The identificationof CTCs bearing characteristics associated with aggressive behavior or resistance toconventional treatment might also help to identify subgroups of patients with poorprognosis. These patients could be offered more aggressive therapeutic approachesand/or targeted therapies against molecules selected according to their expression onCTCs. Thus, during the last years, a growing number of techniques are being developedfor the detection and characterization of CTCs.Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of cancer cells is a process holdingan important role in metastasis formation, during which the epithelial phenotypedynamically converts to a mesenchymal one. These mesenchymal characteristicsenable the initial invasion and intravasation of cancer cells, their migration through thesystemic circulation and the subsequent extravasation and invasion at distant sites. Oneof the major changes during EMT is related to the expression pattern of the cytoskeletonintermediate filaments. Specifically, a significant reduction of cytokeratin expressionalong with a simultaneous increase in vimentin expression is usually observed.Moreover, the expression of molecules involved in cell to cell contacts, induced by aseries of transcription factors, such as TWIST, SNAIL and SLUG is also modulated.The expression of the putative EMT markers, Vimentin and TWIST is consideredessential for the invasion and intravasation of cancer cells in the circulation. In addition,numerous studies have shown that characteristics suggestive of the presence of EMT inprimary tumors, are strongly associated with resistance to chemotherapy, high risk ofrelapse and decreased survival.A growing body of evidence suggests a correlation between the EMT process andthe generation of cancer stem cells (CSCs). CSCs have been identified as a smallsubpopulation in several types of cancers, including breast cancer, and are consideredto bear properties of normal stem cells. The CSC model proposes that these cells only,are capable of self-renewal, unlimited proliferation and differentiation, whereas theyhave also been shown to participate in the metastatic process, giving rise to all thesubpopulations that constitute the primary tumor.Based on the above, the detection of putative EMT and CSC markers on CTCscould distinguish a subpopulation of CTCs demonstrating chemoresistance and enhanced metastatic potential. Several studies during the last years have also reportedthe presence of EMT and CSC characteristics on CTCs by the use of differenttechniques, however there are no clinical studies including well defined groups withlarge number of patients. Moreover, the co-expression of CSC and EMT markers at thesingle CTC level has not yet been reported. On this basis, we investigated whetherCTCs of patients with breast cancer, co-express putative stem cell and intermediateEMT phenotypes. Furthermore, we interrogated the frequency of these CTCsubpopulations among patients with early and metastatic disease, evaluated theirpotential prognostic value.For this purpose, a novel triple immunofluorescence methodology was developedon isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients, for the detectionof cytokeratins 8, 18 and 19 as a CTC marker, along with ALDH1 and TWIST, asputative CSC and EMT markers, respectively. The co-expression of these moleculeswas evaluated at the single cell level by the use of the semi-automated fluorescencemicroscopy system ARIOL.This study has provided a new, sensitive and specific method for thecharacterization of CTCs according to the co-expression of two putative CSC and EMTmarkers. This study showed for the first time that two putative CSC and EMT markersare frequently co-expressed on single CTCs, reinforcing their association.We further investigated whether CTCs bearing the stem cell phenotype, as definedby the high expression of the isoenzyme ALDH1A1, also acquire functional stem cellcharacteristics. The enzymatic activity of ALDH was used as a functional marker ofCSCs, which was evaluated by ALDEFLUOR assay and the use of flow cytometry.Τhe methodology for the detection of ALDH activity on CTCs was developed througha series of experiments using serial dilutions of tumor cells from each cell line intoisolated PBMCs from normal blood donors (dilutions of 10, 100, 1.000 and 10.000 cellsper 106 PBMCs). Tumor cells were detected by the expression of EpCAM and CD45surface molecules instead of cytokeratin, since the evaluation of intracellular proteinscannot be combined with the ALDEFLUOR assay. CTCs could be identified in all theabove dilutions, however an overestimation of cell counts was observed in lowconcentrations of 10 and 100 tumor cells per 106 PBMCs. ALDH activity could also be detected in all dilutions, however the recovery rate was reduced in low cellconcentrations, suggesting that the developed methodology is appropriate for patientsbearing high CTC counts only.Finally, ALDH enzymatic activity was evaluated on CD45-negative cells, whichinclude the subpopulation of CTCs that have completely lost the expression of epithelialmarkers in the context of full EMT. It was shown that ALDH activity in these cells wasincreased, compared to the population of EpCAM-positive/CD45-negative cells,suggesting that the current approach allows the detection of CTCs bearing a fully EMTphenotype and also functional characteristics of CSCs.Less than 5 CTCs were detected in the blood of 65.2% of a CUP population ofpatients, whereas 14.6% were found with 5 or more CTCs by immunofluorescence. Inaddition to immunofluorescence, flow cytometry was used to determine CTCs. Theanalysis of a separate cohort of patients with CUP, revealed the presence of CTCs in64% of cases. Interestingly enough, in the 28% this population more than 50 CTCswere identified per sample. With respect to clinicopathological features, there was alsono detectable relation between CTCs and age at diagnosis, localization of the disease,patients’ performance status, or leukocytosis in CUP (P>0.05). It was also determinedthe association between CTCs’ detection and survival. The difference in overallsurvival between CTCs <5 and CTCs ≥ 5 groups detected by immunofluorescence wasnot statistically significant, whereas, there was just a weak correlation by flowcytometry (P= 0.049).In addition, a statistically significant association was observed betweenclinicopathological parameters and overall survival in CUP patients. Peritonealcarcinomatosis, well differentiated carcinomas and favorable performance status wereassociated with improved survival.To summarize, this study indicated that CTCs were not related to the poor survivalin CUP patients and no correlation exists between CTCs and other commonclinicopathological parameters. Therefore, CTCs might not be a significantly progressand prognostic indicator for CUP patients. Well-designed clinical studies with largecases of CUP should be performed in the future to validate the relationship betweenCTCs and prognosis of CUP patients. Furthermore, we performed a phenotypic analysis of CTCs from CUP patients, regarding the presence of stem cell and partial EMTcharacteristics. The present study provides a new methodology that allows the sensitiveand specific detection of CSC and EMT markers and their co-expression at the singleCTC level. It was also described for the first time that CSC and EMT markers arefrequently co-expressed on the same CTC, further confirming the correlation betweenthe two states in CTCs. Their prognostic value for patients' survival remains to befurther investigated. The present study highlights the significance of the extensivephenotypic analysis of CTCs for the determination of their role in the metastaticprocess, as well as the need for alternative targeted therapies against moleculesassociated with stem cell and EMT features. This approach could contribute to a moreeffective management of CUP patients.

Τα ΚΑΠΕ αντιπροσωπεύουν κατά προσέγγιση το 3% όλων των κακοηθειών του ανθρώπου. Οι ασθενείς με ΚΑΠΕ εκδηλώνονται με μεταστατική νόσο για την οποία δεν είναι δυνατόν να καθορισθεί η πρωτοπαθής εντόπιση κατά τον χρόνο της διάγνωσης μετά από ενδελεχή κλινική-εργαστηριακή διερεύνηση. Μέχρι σήμερα,προηγμένες και περίπλοκες διαγνωστικές μέθοδοι ή και επεμβατικές διαδικασίες απέτυχαν να αυξήσουν τη διαφοροδιαγνωστική ακρίβεια σ' αυτούς τους όγκους όσο και να συνεισφέρουν στο θεραπευτικό όφελος. Ως εκ τούτου έχει γίνει αποδεκτό σήμερα ότι μια περιορισμένη διαφοροδιαγνωστική διαδικασία αρκεί για τη διάγνωση των ΚΑΠΕ. Σ' αυτή συμπεριλαμβάνονται πέραν του λεπτομερούς ιστορικού και της ενδελεχούς φυσικής εξέτασης, βασικός αιματολογικός και βιοχημικός έλεγχος,απεικονιστικές εξετάσεις στις οποίες συμπεριλαμβάνονται ακτινογραφία θώρακος και αξονικές υπολογιστικές τομογραφίες και ενδοσκοπήσεις. Βασική κρίνεται η ανασκόπηση του βιοπτικού υλικού με εκτεταμένη ανοσοϊστοχημική μελέτη. Η τελευταία παρέχει την δυνατότητα ταυτοποίησης χημειοευαίσθητων καρκινωμάτων.Η γνώση της υποκείμενης βιολογίας των ΚΑΠΕ είναι ελλιπής. Από τις υπάρχουσες κλινικές μελέτες είναι γνωστό ότι πρόκειται για μεταστατικούς όγκους ετερογενούς αρχής, οι οποίοι εκδηλώνουν κοινά κλινικά χαρακτηριστικά και προφανώς κοινή βιολογική ταυτότητα. Η σε βάθος γνώση της βιολογίας τους εκτιμάται ότι θα μπορούσε να συνεισφέρει σε ορθολογικότερο σχεδιασμό κλινικών θεραπευτικών σχεδιασμών.Πληθώρα δεδομένων που προκύπτουν από μελέτες με καρκινικές σειρές και μοντέλα ζώων, καθώς και από ασθενείς με καρκίνο, υποδεικνύουν ότι η δημιουργία μεταστάσεων είναι μία πολυσύνθετη διαδικασία. Τα κύρια στάδια του μεταστατικού μηχανισμού είναι αρχικά ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων στην πρωτοπαθή εστία, η διείσδυσή τους στο μεσοκυττάριο χώρο που περιβάλει τον πρωτοπαθή όγκο και η είσοδός τους στη συστηματική κυκλοφορία (ενδαγγείωση),όπου μετακινούνται είτε ως μεμονωμένα κύτταρα, είτε ως συσσωματώματα κυττάρων.Ακολουθεί η μετανάστευσή τους σε απομακρυσμένα σημεία, η έξοδος από την κυκλοφορία (εξαγγείωση) και η διείσδυση σε νέους ιστούς προκειμένου να σχηματίσουν μικρομεταστάσεις. Τέλος, ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός τους στα δευτερεύοντα όργανα που έχουν προσβληθεί οδηγεί στην ανάπτυξη μακροσκοπικά ορατών μεταστάσεων. Οι κυτταρικοί πληθυσμοί που ανιχνεύονται είτε ως ΔΚΚ σε δευτεροπαθείς εστίες, είτε ως ΚΚΚ στο περιφερικό αίμα των ασθενών, αποτελούν τα μικρομεταστατικά κύτταρα.Έως σήμερα, απουσιάζουν μελέτες σχετιζόμενες με ανίχνευση ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών με ΚΑΠΕ. Απεναντίας, σε διαγνωσμένες ασθενείς με καρκίνο μαστού, η παρουσία ΚΚΚ αποτελεί ανεξάρτητο και ισχυρό δείκτη αυξημένης πιθανότητας υποτροπής και μειωμένης ολικής επιβίωσης, τόσο στην πρώιμη όσο και τη μεταστατική νόσο. Επιπλέον, η παρουσία ΚΚΚ σε ασθενείς με καρκίνο μαστού έχει συσχετιστεί με μειωμένη ανταπόκριση στα συνήθη χημειοθεραπευτικά σχήματα. Πέραν όμως της εκτίμησης της παρουσίας των ΚΚΚ, ο μοριακός και φαινοτυπικός χαρακτηρισμός τους αποτελεί κεντρικό θέμα σημαντικής ερευνητικής προσπάθειας από πολλές ομάδες,καθώς δεν διαθέτουν όλα τα ΚΚΚ το ίδιο μεταστατικό δυναμικό. Η περαιτέρω μοριακή ανάλυσή τους θα μπορούσε να αναδείξει τα χαρακτηριστικά εκείνα που ευοδώνουν τη μεταστατική διαδικασία, συμβάλλοντας στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της μετάστασης. Επιπλέον, η μελέτη των ΚΚΚ παρέχει τη δυνατότητα του προσδιορισμού του μοριακού προφίλ του όγκου ανά πάσα χρονική στιγμή και επομένως θεωρείται ως μια υγρή βιοψία «πραγματικού χρόνου». Η ανίχνευση χαρακτηριστικών που σχετίζονται με επιθετική κλινική συμπεριφορά ή με αντίσταση στη θεραπεία στα ΚΚΚ είναι δυνατόν να ταυτοποιήσει υποομάδες ασθενών με φτωχή πρόγνωση. Οι ασθενείς αυτοί πιθανόν είναι υποψήφιοι για πιο επιθετικές θεραπευτικές προσεγγίσεις ή για θεραπεία με νέους στοχεύοντες παράγοντες, οι οποίοι θα μπορούσαν να επιλεγούν ακόμη και με βάση την έκφραση μορίων-στόχων στα ίδια τα ΚΚΚ. Για τους παραπάνω λόγους, τα τελευταία χρόνια αναπτύσσονται ολοένα και περισσότερες τεχνικές για την ανίχνευση και τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών με κακοήθειες Μία σημαντική διαδικασία που λαμβάνει χώρα κατά την ανάπτυξη μεταστάσεων είναι η EMT των καρκινικών κυττάρων, δηλαδή η σταδιακή μετατροπή του επιθηλιακού τους φαινότυπου σε φαινότυπο μεσεγχυματικών κυττάρων. Ο μεσεγχυματικός φαινότυπος που αποκτούν τα καρκινικά κύτταρα διευκολύνει όχι μόνον την αρχική τους διείσδυση μέσω του πρωτοπαθούς όγκου, αλλά και την ενδαγγείωση και μετακίνησή τους μέσω της συστηματικής κυκλοφορίας, καθώς επίσης και την εξαγγείωση και τελικά τη διείσδυσή τους στο νέο όργανο. Μία από τις κύριες αλλαγές που παρατηρούνται κατά την EMT αφορά στο πρότυπο έκφρασης των ενδιάμεσων ινιδίων του κυτταροσκελετού, όπου παρατηρείται γενικά σημαντική μείωση στην έκφραση της κυτταροκερατίνης, με παράλληλη αύξηση στην έκφραση της βιμεντίνης, η οποία αποτελεί έναν ισχυρό δείκτη EMT και εμφανίζεται απαραίτητη για τη διείσδυση και ενδαγγείωση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, σημαντική αλλαγή παρατηρείται στην έκφραση των μορίων που ενέχονται στις διακυτταρικές επαφές, η οποία έχει βρεθεί ότι επάγεται μέσω μιας σειράς μεταγραφικών παραγόντων,όπως είναι οι TWIST, SNAIL και SLUG. Ο μεταγραφικός παράγοντας TWISTαποτελεί ένα ιδιαίτερα σημαντικό δείκτη EMT, ο οποίος ενέχεται σε διάφορα στάδια της μεταστατικής διαδικασίας, όπως η αρχική διείσδυση και η ενδαγγείωση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, πολυάριθμες μελέτες έχουν συσχετίσει την παρουσία χαρακτηριστικών συμβατών με EMT στον πρωτοπαθή όγκο των ασθενών με αυξημένη αντίσταση στη χημειοθεραπεία με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής και μειωμένη επιβίωση. Όπως υποδεικνύεται από πολλές μελέτες τα τελευταία χρόνια, η EMT σχετίζεται άμεσα με τη γένεση ΚΒΚ. Τα ΚΒΚ έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου,συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, ως ένας μικρός υποπληθυσμός κυττάρων με ιδιότητες χαρακτηριστικές των βλαστικών κυττάρων. Σύμφωνα με το μοντέλο των ΚΒΚ, τα κύτταρα αυτά θεωρούνται ως τα μόνα ικανά να «αυτοανανεώνονται»,να πολλαπλασιάζονται απεριόριστα και να διαφοροποιούνται,επάγοντας το σχηματισμό όλων των κυτταρικών υποπληθυσμών που απαρτίζουν τον πρωτοπαθή όγκο. Επιπλέον είναι γνωστό ότι τα ΚΒΚ συμμετέχουν ενεργά στην ανάπτυξη μεταστάσεων, καθώς ευθύνονται για τη διασπορά του πρωτοπαθούς όγκου,δίνοντας γένεση σε όλους τους υποπληθυσμούς του. Σύμφωνα με τα παραπάνω, η EMT και η προτεινόμενη θεωρία των ΚΒΚ πιστεύεται ότι κατέχουν σημαντική θέση στην βιολογία των ΚΚΚ. Η παρουσία δεικτών ΚΒΚ ή EMT στα ΚΚΚ πιθανόν ταυτοποιεί έναν κυτταρικό υποπληθυσμό με αυξημένη ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία και ενισχυμένη ικανότητα να δημιουργεί μεταστάσεις. Όλο και περισσότερες μελέτες τα τελευταία χρόνια διερευνούν με διάφορες μεθοδολογίες την παρουσία δεικτών για EMT και ΚΒΚ στα ΚΚΚ ασθενών με καρκίνο μαστού, εντούτοις δεν υπάρχουν κλινικές μελέτες που να περιγράφουν το φαινόμενο σε καλά καθορισμένες ομάδες με μεγάλους αριθμούς ασθενών. Επιπλέον,δεν έχει δειχθεί έως σήμερα η σύγχρονη έκφραση δεικτών ΚΒΚ και EMT στα ΚΚΚ σε επίπεδο μονήρων κυττάρων. Με βάση τα παραπάνω, σχεδιάστηκε η παρούσα μελέτη για τη διερεύνηση της παρουσίας ΚΚΚ που φέρουν παράλληλα φαινότυπους ΚΒΚ και ενδιάμεσης EMT σε ασθενείς με καρκίνο μαστού. Στόχος ήταν η διερεύνηση της συχνότητάς τους σε ασθενείς με πρώιμη και μεταστατική νόσο, η εκτίμηση της πιθανής αντίστασής τους στη χημειοθεραπεία, καθώς επίσης της προγνωστικής τους αξίας.Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε μία νέα μεθοδολογία τριπλού ανοσοφθορισμού σε απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος των ασθενών, μέσω της οποίας ελέγχθηκε η έκφραση των κυτταροκερατινών 8, 18 και 19 για τον εντοπισμό των ΚΚΚ, ενώ ως δείκτες ΚΒΚ και EMT χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα η ALDH1 και το TWIST. Η συνέκφραση των παραπάνω μορίων αξιολογήθηκε σε επίπεδο μονήρων κυττάρων μέσω του ημι-αυτοματοποιημένου συστήματος μικροσκοπίας φθορισμούARIOL. Επιπλέον, μέσω μίας σειράς πειραμάτων ελέγχου με τη χρήση των παραπάνω καρκινικών σειρών, καθώς επίσης και δείγματος φυσιολογικών αιμοδοτών,επιβεβαιώθηκε η υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα της μεθόδου ανίχνευσης των δύο δεικτών στα ΚΚΚ. Η παρούσα μελέτη προσέφερε μία νέα, ευαίσθητη και ειδική μεθοδολογία για τοχαρακτηρισμό των ΚΚΚ ως προς τη συνέκφραση δύο πολύ σημαντικών δεικτών ΚΒΚ και EMT. Τέλος, διαπιστώθηκε για πρώτη φορά η συνέκφραση δύο σημαντικών δεικτών ΚΒΚ και EMT σε επίπεδο μονήρων ΚΚΚ, ενισχύοντας ακόμη περισσότερο τη μεταξύ τους συσχέτιση.Στη συνέχεια, διερευνήθηκε εάν τα ΚΚΚ που εμφανίζουν το φαινότυπο ΚΒΚ όπως ορίστηκε βάσει της υψηλής έκφρασης του ισοένζυμου ALDH1Α1, φέρουν και λειτουργικά χαρακτηριστικά των ΚΒΚ. Ως δείκτης λειτουργικότητας ΚΒΚ χρησιμοποιήθηκε η ενζυμική ενεργότητα της ALDH, ο έλεγχος της οποίας πραγματοποιήθηκε μέσω κατάλληλης μεθοδολογίας, γνωστής ως δοκιμήALDEFLUOR με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Η μέθοδος ανίχνευσης της ενεργότητας ALDH στα ΚΚΚ αναπτύχθηκε μέσω μίας σειράς πειραμάτων σε διαδοχικές αραιώσεις των καρκινικών κυττάρων της κάθε σειράς σε απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα αίματος φυσιολογικών αιμοδοτών (αραιώσεις των 10, 102, 103 και 104 κυττάρων ανά 106 αιμοποιητικών κυττάρων). Η ταυτοποίηση των καρκινικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε μέσω της ανίχνευσης της έκφρασης των μορίων της επιφάνειας EpCAM και CD45, έναντι της κυτταροκερατίνης, καθώς η δοκιμήALDEFLUOR δεν επιτρέπει τη σύγχρονη ταυτοποίηση ενδοκυττάριων μορίων. Σε συμφωνία με άλλες μελέτες ανίχνευσης ΚΚΚ μέσω κυτταρομετρίας ροής, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η μέθοδος εμφανίζει υψηλή ευαισθησία, ωστόσο στις μεγάλες αραιώσεις των 10 και 100 καρκινικών κυττάρων παρατηρήθηκε υπερεκτίμηση του αριθμού των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, η ανίχνευση της ενεργότητας της ALDHπραγματοποιήθηκε με μεγάλη ευαισθησία στο σύνολο των αραιώσεων, ωστόσο και εδώ παρατηρήθηκε μείωση της ποσοστιαίας ενεργότητας με την αυξανόμενη αραίωσητων καρκινικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε ενδείκνυται για ασθενείς με υψηλό φορτίο ΚΚΚ. Τέλος, μέσω της κυτταρομετρίας ροής ήταν δυνατή η εκτίμηση της ενεργότητας της ALDH στο σύνολο CD45-αρνητικών κυττάρων ανεξάρτητα από την έκφραση τουEpCAM, στα οποία συμπεριλαμβάνεται μεταξύ άλλων ο υποπληθυσμός των ΚΚΚ με πλήρη απώλεια έκφρασης επιθηλιακών δεικτών στα πλαίσια της ολοκληρωμένης EMT.Όπως διαπιστώθηκε, η ενεργότητα της ALDH στο συγκεκριμένο πληθυσμό κυττάρων ήταν αυξημένη συγκριτικά με τον πληθυσμό των EpCAM-θετικών/CD45-αρνητικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η παραπάνω προσέγγιση επιτρέπει την ανίχνευση του πληθυσμού των ΚΚΚ με πλήρη EMT και παράλληλα λειτουργικό χαρακτήρα ΚΒΚ. Λιγότερα των 5 ΚΚΚ ταυτοποιήθηκαν στο 65,2% του πληθυσμού των ασθενών με ΚΑΠΕ της μελέτης, ενώ στο 14,6% ανευρέθηκαν ≥ 5 ΚΚΚ με ανοσοφθορισμό. Επιπροσθέτως του ανοσοφθορισμού, εφαρμόστηκε και κυτταρομετρία ροής για την ανίχνευση ΚΚΚ. Η διενεργηθείσα ανάλυση σε ανεξάρτητο πληθυσμό ασθενών με ΚΑΠΕ συγκριτικά με τον ανοσοφθορισμό, αποκάλυψε την παρουσία ΚΚΚ στο 64%των περιπτώσεων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η διαπίστωση ότι στο 28% του συγκεκριμένου πληθυσμού, βρέθηκαν περισσότερα των 50 ΚΚΚ κατά περίπτωση. Αναφορικά με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους, δεν ανιχνεύτηκε συσχέτιση μεταξύ των ΚΚΚ και της ηλικίας κατά τη διάγνωση της νόσου, της εντόπισής της, της λειτουργικής κατάστασης των ασθενών ή της λευκοκυττάρωσης (P>0.05). Επίσης καθορίστηκε η συσχέτιση της παρουσίας ΚΚΚ με την επιβίωση. Η διαφορά στη συνολική επιβίωση μεταξύ των δύο υποομάδων ασθενών με ΚΚΚ ≥ 5 έναντι <5 όπως αυτά ανιχνεύτηκαν με τον ανοσοφθορισμό, δεν ήταν στατιστικώς σημαντική, ενώ ασθενής συσχέτιση προέκυψε από την κυτταρομετρία ροής (P= 0.049).Επιπλέον, στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων και της συνολικής επιβίωσης των ασθενών με ΚΑΠΕ. Η περιτοναϊκή καρκινωμάτωση, τα καλά διαφοροποιημένα καρκινώματα και η ικανοποιητική λειτουργική κατάσταση των ασθενών συνδέονται με βελτιωμένη επιβίωση. Συνοψίζοντας, αυτή η μελέτη υποδεικνύει ότι η παρουσία ΚΚΚ σε ασθενείς με ΚΑΠΕ, δε συνοδεύεται από φτωχή επιβίωση ενώ καμία συσχέτισή τους δεν αναγνωρίστηκε με μια σειρά κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων. Επομένως, τα ΚΚΚ δεν αποτελούν προγνωστικό παράγοντα των ΚΑΠΕ. Καλά σχεδιασμένες κλινικές δοκιμές σε ικανό αριθμό ασθενών με ΚΑΠΕ επιβάλλεται να πραγματοποιηθούν στο μέλλον, προκειμένου να επικυρωθεί η διαπίστωση αυτή. Επιπλέον, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε μία φαινοτυπική ανάλυση των ΚΚΚ ασθενών με ΚΑΠΕ, ως προς την παρουσία χαρακτηριστικών ΚΒΚ και ενδιάμεσης EMT. Η παρούσα μελέτη προσέφερε μία νέα μεθοδολογία για την ευαίσθητη και ειδική ανίχνευση της συνέκφρασης δύο σημαντικών δεικτών ΚΒΚ καιEMT στα ΚΚΚ σε επίπεδο κυττάρου. Επίσης περιγράφηκε για πρώτη φορά η σύγχρονη έκφραση δεικτών ΚΒΚ και EMT στο ίδιο κύτταρο, επιβεβαιώνοντας τη συσχέτιση μεταξύ των δύο χαρακτηριστικών στα ΚΚΚ. Η προγνωστική αξία της ανίχνευσης ΚΚΚ ως προς την επιβίωση των ασθενών μένει να διερευνηθεί περαιτέρω. Με την παρούσα μελέτη αναδεικνύεται αφενός η σημασία της εκτενούς φαινοτυπικής μελέτης των ΚΚΚ για την αποσαφήνιση του ρόλου τους στη μεταστατική διαδικασία και αφετέρου η ανάγκη εύρεσης εναλλακτικών θεραπειών που θα στοχεύουν σε μόρια που σχετίζονται άμεσα με τα χαρακτηριστικά ΚΒΚ και EMT. Μια τέτοια προσέγγιση θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση των ασθενών με ΚΑΠΕ.