Investigation of new therapeutic targets for the treatment of diabetic retinopathy: neurosteroids/microneurotrophins

Abstract

Diabetic Retinopathy (DR) is a major ocular complication of diabetes that leads to suboptimal visual acuity and blindness. This disease has been characterized by three pathogenic processes that underlie the mechanisms leading to retinal cell death, namely, inflammation, neurodegeneration and microangiopathy. Standard therapies for DR rely on laser surgery and intravitreal injections of corticosteroids or anti-angiogenic factors like anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) agents, which inhibit and/or reverse the vascular damage. These therapies are effective but have various side effects. New pharmacological approaches are essential in order to treat the inflammatory and neurodegenerative components of the disease. In the present study, we investigated the putative use of the neurosteroidal microneurotrophin BNN27, a 17-spiro DHEA analogue, as a potential therapeutic agent for the treatment of DR. BNN27 has been described as a microneurotrophin given that it is a small-sized molecule and acts as a Nerve Growth Factor (NGF) mimetic that binds specifically to its receptors, TrkA and p75 neurotrophin receptors. Furthermore, it is highly lipophilic, thus able to penetrate the blood brain barrier and it is not metabolized to estrogens or androgens. Employing the STZ-rat model of DR, BNN27 was administered at three doses, 2, 10 and 50mg/kg, either intraperitoneally or by eye-drops, 4 weeks post-STZ-injection for 7 days. We demonstrated the ability of BNN27 to exert its neuroprotective properties to the diabetic retina despite sustained high glucose levels in diabetic rats.BNN27 restored the STZ-induced attenuation of bNOS- and TH-immunoreactivity (IR; retinal amacrine cell markers) and NFL-IR (ganglion cell axon marker) when administered both intraperitoneally and as eye drops. This was further substantiated by the BNN27-dependent activation/phosphorylation of the NGF TrkA receptor. Moreover, a specific TrkA receptor antagonist reversed BNN27's actions. These data strongly suggest that BNN27 mediates its pharmacological pro-survival actions in the diabetic rat retina by activating specifically the NGF TrkA receptor. BNN27 also attenuated the expression of p75NTR death receptor in the diabetic retina when administered intraperitoneally. However, it did not reverse the diabetes-induced increase in TUNEL+ retinal cells but it did attenuate the diabetes-induced activation of cleaved caspase-3. BNN27 also reduced the diabetes-induced up-regulation of the GFAP protein, expressed in Müller macroglial cells and the number of Iba-1-expressing microglia. Finally, BNN27 restored retinal homeostasis after the diabetes-induced imbalance between the two isoforms of NGF, mature NGF and immature proNGF, in the diabetic rat retina.In conclusion, the microneurotrophin BNN27 exerts neuroprotective actions to the diabetic rat retina when administered either intraperitoneally or by eye drops. BNN27 was shown to specifically target retinal neurons and glial cells, acting as a pro-survival and anti-inflammatory agent, respectively. It displays the pharmacological profile needed to address the neurodegenerative and inflammatory parameters that characterize DR. Our results advocate that this novel microneurotrophin, BNN27, has the potential to become a “lead” molecule for the treatment for DR.

Η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια (ΔΑ) αποτελεί κύρια και συχνά εμφανιζόμενη επιπλοκή του σακχαρώδη διαβήτη που οδηγεί στη μείωση της οπτικής οξύτητας και στην τύφλωση. Η ΔΑ χαρακτηρίζεται από τρεις παθολογικές παραμέτρους τη μικροαγγειακή βλάβη, τη νευροεκφύλιση και την φλεγμονή. Οι μέχρι σήμερα καθιερωμένες θεραπείες για την αντιμετώπιση της ΔΑς είναι η φωτοπηξία με λέϊζερ και οι ενδοϋαλοειδικές εγχύσεις κορτικοστεροειδών ή αντι-αγγειογενετικών παραγόντων όπως του αντί-Αγγειο-Ενδοθηλιακού Αυξητικού Παράγοντα (VEGF), οι οποίες στοχεύουν στη μείωση της μικροαγγειακής βλάβης. Οι θεραπείες αυτές είναι αποτελεσματικές, αλλά παρουσιάζουν σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες. Νέες φαρμακολογικές προσεγγίσεις απαιτούνται για την αντιμετώπιση και των τριών παραμέτρων της ΔΑς. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την πιθανή χρήση της νευροστεροειδούς-προέλευσης μικρονευροτροφίνης ΒΝΝ27, ενός συνθετικού σπιρο-αναλόγου (17-spiro-DHEA) της Διϋδροεπιανδροστερόνης (Dehydroepiandrosterone, DHEA), ως δυνητικού θεραπευτικού παράγοντα για τη θεραπεία της ΔΑς. Η ΒΝΝ27 χαρακτηρίστηκε ως μικρονευροτροφίνη δεδομένου ότι είναι μικρού μεγέθους μόριο, μιμείται τη δράση του Νευρικού Αυξητικού Παράγοντα (NGF) κι επομένως δρα ως αγωνιστής των υποδοχέων του, δεσμευόμενη ειδικά με τους NGF TrkA και p75NTRυποδοχείς. Επιπλέον, είναι ιδιαίτερα λιπόφιλο μόριο, κι ως εκ τούτου είναι ικανό να διεισδύσει στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, και στερείται οιστρογονικών και ανδρογονικών δράσεων. Χρησιμοποιώντας το ζωϊκό μοντέλο στρεπτοζοτοκίνης (streptozotocin, STZ) για την πρόκληση διαβήτη στον αρουραίο, χορηγήθηκε η BNN27 σε τρεις δοσολογίες, των 2, 10 και 50mg/kg, είτε ενδοπεριτοναϊκά είτε με τοπική έγχυση οφθαλμικών σταγόνων, 4 εβδομάδες μετά τη χορήγηση STZ, για 7 ημέρες. Η ΒΝΝ27 εμφάνισε νευροπροστατευτικές δράσεις στον διαβητικό αμφιβληστροειδή παρά τα διατηρούμενα υψηλά επίπεδα γλυκόζης στους διαβητικούς αρουραίους.Η BNN27 αποκατέστησε την προκαλούμενη από τη STZ μείωση της bNOS και ΤΗ-ανοσοδραστικότητας (δείκτες αμακρινικών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς) και την NFL-ανοσοδραστικότητα (δείκτης αξόνων των γαγγλιακών κυττάρων) μετά από ενδοπεριτοναϊκή ή τοπική υπό μορφή οφθαλμικών σταγόνων χορήγηση. Επιπροσθέτως, ο ειδικός ανταγωνιστής του TrkA υποδοχέα αντέστρεψε τις προστατευτικές δράσεις του BNN27. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η BNN27 διεκπεραιώνει τις φαρμακολογικές προ-επιβιωτικές δράσεις της στο διαβητικό αμφιβληστροειδή αρουραίου μέσω της ενεργοποίησης ειδικά του NGF TrkA υποδοχέα. Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την ΒΝΝ27 προκαλούμενη ενεργοποίηση / φωσφορυλίωση του NGF TrkA υποδοχέα. Η ΒΝΝ27 χορηγούμενη ενδοπεριτοναϊκά μείωσε την έκφραση του υποδοχέα θανάτου p75NTR στο διαβητικό αμφιβληστροειδή. Ωστόσο, το BNN27 δεν ανέστρεψε την επαγόμενη από το διαβήτη αύξηση στα TUNEL+ κύτταρα του αμφιβληστροειδούς, αλλά εξασθένησε την επαγόμενη από το διαβήτη ενεργοποίηση της κασπάσης-3. Η BNN27 μείωσε επίσης την επαγώμενη από το διαβήτη ανοδική ρύθμιση της πρωτεΐνης GFAP, που εκφράζεται στα μακρογλοιακά κύτταρα Müller, και τον αριθμό των ενεργοποιημένων μικρογλοιακών κυττάρων (Iba-1 ανοσοδραστικότητα). Εντέλει, ο διαβήτης προκάλεσε ανισορροπία μεταξύ των επιπέδων των δύο ισομορφών του NGF, της ώριμης (NGF) κι ανώριμης (proNGF) ισομορφής, στον αμφιβληστροειδή αρουραίου. Η χορήγηση της BNN27 αποκατέστησε την ισορροπία αυτή δρώντας ομοιοστατικά στον αμφιβληστροειδή.Συμπερασματικά, η μικρονευροτροφίνη ΒΝΝ27 ασκεί νευροπροστατευτικές δράσεις στον διαβητικό αμφιβληστροειδή αρουραίου όταν χορηγείται είτε ενδοπεριτοναϊκά είτε με οφθαλμικές σταγόνες. Η BNN27 έδειξε ότι στοχεύει ειδικά τους νευρώνες και τα γλοιακά κύτταρα του αμφιβληστροειδούς, δρώντας ως νευροπροστατευτικός κι αντιφλεγμονώδης παράγοντας, αντίστοιχα. Διαθέτει το φαρμακολογικό προφίλ που απαιτείται για την αντιμετώπιση των νευροεκφυλιστικών και φλεγμονωδών παραμέτρων που χαρακτηρίζουν τη ΔΑ. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν ότι η καινοφανής νευροτροφίνη BNN27 θα μπορούσε δυνητικά να χαρακτηριστεί ως πρωτότυπο μόριο-οδηγός για τη θεραπεία της ΔΑς.