Μηχανισμοί διαφοροποίησης εμβρυονικών βλαστικών κυττάρων προς κυτταρικούς τύπους μεσοδερμικής προέλευσης

Abstract

Formation of the cardiovascular system is one of the earliest differentiation events during embryogenesis. During heart development, endothelial-cardiomyocyte interactions are essential for the survival, growth and contractile activity of cardiomyocytes. However, little is known about the specific nature of the functional interaction between endothelium and cardiomyocytes during early cardiomyocyte lineage specification. Adherens junctions (AJs) are cell-cell adhesion structures pivotal to morphogenetic processes, lineage specification and proliferation. They provide not only mechanical support to forming tissues but they are also involved in segregation of various cell-types emerging during differentiation. Nonetheless, the nature of cadherin mediated junctions between endothelial and cardiac progenitor cells, before their specification into mature phenotypes, has not been investigated. To identify the role of AJs during cardiac and endothelial lineages specification at the earliest differentiation stages of cardiovascular system formation and the functional interactions between these lineages, we use as an in vitro model the differentiation of mouse embryonic stem (mESCs) cells after embryoid bodies (EBs) formation in the presence of appropriate growth factors that favor endothelial differentiation. Under these conditions, cardiac differentiation was also very efficient. Cardiomyocyte lineage specification is spatially related to endothelium as these populations are in close proximity at all stages of their development. Examination of Isl1+ multipotent cardiovascular progenitors showed that they form mostly N-cadherin-mediated AJs. However, a percentage of them, also expresses the endothelial-specific VE-cadherin in a transient fashion. In accordance, VE-cadherin promoter (Pvec) activity pattern in genetically modified ESCs showed that it is transiently activated in a subset of Isl1+ progenitors, in addition to endothelial cells. Impairment of adhesive activity by a AJs dominant-negative mutant under VE-cadherin promoter disrupts endothelial integrity and inhibits Isl1+ cells pre-specification in mutant EBs. This phenotype was reversed after AJs formation rescue in hybrid EBs derived from wt/mutant ESCs. In conclusion, vascular and cardiac progenitors are closely related populations from the earliest stages of their development and AJs-mediated cell-cell adhesion positively regulates differentiation and specification of cardiovascular progenitors.Using a genetic engineered approach, based on VE-cadherin promoter and drug selection, a mixed population of endothelial and cardiac progenitor cells (CEDPs) were isolated during in vitro differentiation of genetically modified ESCs. CEDPs were further expanded in vitro by activation of Wnt/b-catenin signalling, maintaining them undifferentiated. Injection of the dual population in the left ventricle of immuno-suppressed healthy rats or in acute myocardial infarction rat models, shown that CEDPs survived and differentiated efficiently in vivo.

Ο σχηματισμός του καρδιαγγειακού συστήματος λαμβάνει χώρα κατά τα πρώιμα στάδια της εμβρυογένεσης. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων με τα καρδιομυοκύτταρα, είναι απαραίτητες για την επιβίωση, την ανάπτυξη καθώς και για την τελική διαφοροποίηση των καρδιομυοκυττάρων. Ωστόσο, οι λειτουργικές αυτές αλληλεπιδράσεις κατά την πρώιμη ιστική εξειδίκευση των καρδιομυοκυττάρων δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς. Οι διακυτταρικοί σύνδεσμοι προσκόλλησης κατέχουν εξέχοντα ρόλο σε πολλαπλές μορφογενετικές διαδικασίες. Παρέχουν μηχανική στήριξη στους σχηματιζόμενους ιστούς και εμπλέκονται στην εξειδίκευση ποικίλων κυτταρικών τύπων κατά τη διαφοροποίηση. Παρόλα ταύτα δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως ο ρόλος τους κατά τα πρώιμα στάδια σχηματισμού των ενδοθηλιακών και καρδιακών προγονικών κυττάρων. Για να μελετηθούν οι αλληλεπιδράσεις ενδοθηλιακών και καρδιακών προγονικών κυττάρων καθώς και οι διακυτταρικοί σύνδεσμοι προσκόλλησης κατά τη δημιουργία του καρδιαγγειακού συστήματος χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο της εμβρυογένεσης, η in vitro διαφοροποίηση Εμβρυονικών Βλαστικών κυττάρων μυός (mESCs) μέσω σχηματισμού εμβρυοειδών σωματιδίων (ΕBs). Παρουσία αυξητικών παραγόντων που προάγουν τη δημιουργία του ενδοθηλίου, επάγεται επιτυχώς η διαφοροποίηση ενδοθηλιακών αλλά και καρδιακών κυττάρων. Η εξειδίκευση των καρδιομυοκυττάρων εμφανίζεται να έχει στενή σχέση με τα ενδοθηλιακά κύτταρα καθώς οι δύο κυτταρικοί τύποι διαφοροποιούνται σε άμεση γειτνίαση κατά τη διάρκεια όλων των σταδίων της ανάπτυξης τους. Τα πλειοδύναμα Isl1+καρδιαγγειακά προγονικά κύτταρα σχηματίζουν N-cadherin συνδέσμους προσκόλλησης, ενώ ένας υποπληθυσμός αυτών, εκφράζει επιπρόσθετα και VE-cadherin για καθορισμένο χρονικό διάστημα. Σε συμφωνία με το παραπάνω αποτέλεσμα, ανιχνεύθηκε παροδική ενεργότητα του υποκινητή της VE-cadherin (Pvec) σε έναν υποπληθυσμό των Isl1+ κυττάρων, επιπλέον των ενδοθηλιακών κυττάρων. Έκφραση ενός μεταλλάγματος με αρνητικώς επικρατούσα δράση cadherin υπό τον Pvec έχει σαν αποτέλεσμα την αποσυναρμολόγηση της ακεραιότητας του ενδοθηλίου και παράλληλα την αναστολή της εξειδίκευσης των Isl1+ κυττάρων στα μεταλλαγμένα EBs. Ο φαινότυπος αυτός αντιστρέφεται έπειτα από μερική αποκατάσταση των διακυτταρικών συνδέσμων προσκόλλησης σε υβριδικά EBs τα οποία προέρχονται από μεταλλαγμένα και αγρίου τύπου ESCs. Εν κατακλείδι, τα ενδοθηλιακά και τα καρδιακά προγονικά κύτταρα εμφανίζουν στενή σχέση από τα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης τους, ενώ οι διακυτταρικοί σύνδεσμοι προσκόλλησης ρυθμίζουν τη διαφοροποίηση και την εξειδίκευση των καρδιαγγειακών κυττάρων. Περαιτέρω, πραγματοποιήθηκε ταυτόχρονη απομόνωση ενδοθηλιακών και καρδιακών προγονικών κυττάρων (CEDPs) κατά τη διαφοροποίηση γενετικώς τροποποιημένων ESCs έπειτα από επιλογή υπό τον Pvec. Τα CEDPs εκπτύσσονται in vitro διατηρώντας την «αδιαφοροποίητη» κατάσταση τους έπειτα από την ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt/ b-catenin. Μεταμόσχευση τους σε φυσιολογικές αλλά και εμφραγματικές καρδιές επιμύων κατέδειξε ότι ο διπλός πληθυσμός επιβιώνει και διαφοροποιείται επιτυχώς.