Investigation of the role of inotropy in doxorubicin induced cardiotoxicity

Abstract

The antitumor agent doxorubicin (DXR) can cause cardiomyopathy and heart failure (HF). Levosimendan (LEVO) is a drug clinically used for the treatment of HF. However, the underlying mechanism of LEVO on DXR cardiotoxicity is unknown.Aim: We investigated i. the effect of different doses of LEVO on acute DXR cardiotoxicity, ii. its effects after repeated and/or single administration on sub-chronic DXR cardiotoxicity in rats, iii. The underlying signaling mechanisms, iv. its effects on phospholamban knockout mice (PLN KO) and v. its effects on an in vivo MMTV-Neu murine breast cancer (BC) model of chronic DXR cardiotoxicity.Methods: Initially, prostate cancer (PC3) cell line was treated with a wide range of DXR and LEVO concentrations either alone or in combination, in order to investigate a possible interaction between LEVO and DXR as far as the cytotoxicity of the latter is concerned. Subsequently, Wistar male rats were randomly assigned into 5 groups for acute [Control (N/S 0.9%), DXR (20mg/kg), DXR+LEVOA (LEVO at 12μg/kg) and DXR+LEVOB (LEVO at 24μg/kg), DXR+LEVOB+5HD (5HD at 40 mg/kg), interventions were performed for 3 consecutive days] and 6 groups for sub-chronic DXR cardiotoxicity [Control (N/S 0.9%), DXR (18mg/kg divided in 4 equal doses), DXR+LEVO (LEVO at 24 μg/kg divided in 4 equal doses), DXR+LEVO+5HD (5HD at 40 mg/kg on alternate days) DXR+LEVO(ac) (LEVO acutely at 24 μg/kg), DXR+LEVO(ac)+5HD (5HD at 40 mg/kg on alternate days), interventions were performed for 14 consecutive days]. Histological and molecular analysis was performed in all the aforementioned protocols. PLN ΚΟ mice were divided in 2 groups [PLN ΚΟ DXR (18mg/kg) and PLN ΚΟ DXR+LEVO(ac) (LEVO acutely at 24 μg/kg), interventions were performed for 14 consecutive days]; Female BC mice in 4 groups [Control, DXR (18mg/kg), DXR+LEVO(ac) (LEVO acutely at 24 μg/kg) and LEVO(ac), interventions were performed for 28 consecutive days]. Cardiac function was assessed echocardiographically in all the above protocolsResults: In the in vitro experiments on the PC3 cell line, when LEVO co-administered with DXR it did not abrogate DXR antitumor potency. On the contrary a possible synergy between the two compounds was evident. In the acute DXR cardiotoxicity protocol, LEVO reduced morphological changes (namely vacuolization, focal disruption of myocardial fibers and mononuclear cell infiltration) at both doses. Moreover, it dose-dependently reduced malondialdehyde (MDA) and protein carbonyls (PCs) while it decreased MMP2 mRNA expression at the high dose. Only LEVO at the highest dose regulated oxidative stress related proteins, as presented by the decrease in iNOS and NOX4 and led to an increase in Akt, eNOS and AMPK phosphorylation. In the sub-chronic DXR cardiotoxicity protocol, the single bolus dose of LEVO favorably restored myocardial contractility and abrogated morphological DXR-induced cardiac defects (namely vacuolization and mononuclear cell infiltration). Single-dose and repeated administration of LEVO presented the same antioxidant potency as far as reduction of MDA, PCs, iNOS and NOX-4 are concerned, as well as upregulated MnSOD. However, only the single dose of LEVO led to a phosphorylation of Akt, eNOS and AMPK and activation of cGMP-PKG and cAMP-PKA axis as shown by elevated cGMP and cAMP levels and VASP phopshorylation. Consecutively, only the single dose of LEVO led to the phosphorylation of phospholamban (PLN). On the contrary single dose-LEVO, did not presented any beneficial effects on PLN-KO mice, a fact revealing the pivotal role of PLN in LEVO cardioprotective effect. Finally, in the murine model of BC mice, LEVO abrogated BC cardiac dysfunction induced by sub-chronic DXR induced cardiomyopathy and increased survival. Conclusions: Single-dose LEVO prevented DXR cardiomyopathy through cGMP/cAMP-PLN pathways. highlighting the role of inotropic stimulation in DXR cardiotoxicity and providing the grounds for further clinical testing of LEVO in this setting.

Ο αντικαρκινικός παράγοντας δοξορουβικίνη (DXR) μπορεί να προκαλέσει καρδιομυοπάθεια και μη αντιστρεπτή καρδιακή ανεπάρκεια (ΚΑ). Η Λεβοσιμεντάνη (LEVO) είναι ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται κλινικά για τη θεραπεία της ΚΑ. Ωστόσο, η επίδραση της LEVO επί της καρδιοτοξικότητας που επάγεται από την DXR παραμένει άγνωστη.Σκοπός: Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση i. της επίδρασης διαφορετικών δόσεων LEVO στην οξεία καρδιοτοξικότητα που επάγεται από την DXR, ii. Την επίδραση της LEVO μετά από επανειλημμένη ή εφ άπαξ χορήγηση σε μοντέλο υπο-χρόνιας καρδιοτοξικότητας που επάγεται από την DXR σε επίμυες, iii. Των υποκείμενων μηχανισμών σηματοδότησης, iv. Την επίδραση της LEVO σε μύες με γενετική εξάλειψη της φωσφολαμβάνης (PLN KO) και v. Των επιδράσεων της σε ένα μοντέλο χρόνιας καρδιοτοξικότητας που επάγεται από την DXR σε in vivo μοντέλο MMTV-Neu καρκίνου του μαστού (BC). Μέθοδοι: Αρχικά, η κυτταρική σειρά του καρκίνου του προστάτη (PC3) υποβλήθηκε σε χορήγηση ενός ευρέως φάσματος συγκεντρώσεων DXR και LEVO είτε ως μονοχορηγήσεις είτε σε συνδυασμό, προκειμένου να διερευνηθεί μια πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ των LEVO και DXR όσον αφορά την κυτταροτοξικότητα του τελευταίου.Αρσενικοί επίμυες Wistar τυχαιοποιήθηκαν σε 5 ομάδες για την μελέτη της οξείας καρδιοτοξικότητας (Control (N / S 0,9%), DXR (20mg / kg), DXR + LEVOA (LEVO σε δόση 12μg / kg) και DXR + LEVOB ), DXR + LEVOB + 5ΗD (5ΗD σε δόση 40 mg / kg), επί 3 διαδοχικές ημέρες] και 6 ομάδες για την μελέτη της υπο-χρόνιας καρδιοτοξικότητας που επάγεται από την DXR [Control, DXR (18mg / kg, διαιρεμένη σε 6 δόσεις), DXR + LEVO(LEVO σε δόση 24μg / kg, διαιρεμένη σε 4 δόσεις), DXR + LEVO (ac) (LEVO εφ άπαξ σε δόση 24 μg / kg), DXR + LEVO (ac) + 5ΗD (5ΗD στα 40 mg / kg μέρα παρά μέρα), για 14 διαδοχικές ημέρες]. Ιστοπαθοψλογική αξιολόγηση και μελέτη του υποκείμενου μηχανισμού σηματοδότησης πραγματοποιήθηκε σε όλα τα προαναφερθέντα πρωτόκολλα. Οι μύες PLN ΚΟ διαιρέθηκαν σε 2 ομάδες [PLN ΚΟ DXR (18 mg / kg) και PLN ΚΟ DXR + LEVO (ac) (LEVO εφ άπαξ σε δόση 24 μg / kg), για 14 διαδοχικές ημέρες]. Τα θηλυκά BC ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε 4 ομάδες [Control, DXR (18mg / kg), DXR + LEVO (ac) (LEVO εφ άπαξ σε δόση 24 μg / kg) και LEVO (ac), για 28 διαδοχικές ημέρες]. Η καρδιακή λειτουργία εκτιμήθηκε ηχοκαρδιογραφικά σε όλα τα παραπάνω πρωτόκολλαΑποτελέσματα: Στα in vitro πειράματα επί της κυτταρικής σειράς PC3, η LEVO δεν ανέστειλε την in vitro αντικαρκινική δράση της DXR. Αντίθετα, φάνηκε να υπάρχει μια πιθανή συνέργεια μεταξύ των δύο παραγόντων. Στο πρωτόκολλο οξείας καρδιοτοξικότητας από την DXR, η LEVO ανέστειλε τις μορφολογικές αλλοιώσεις (αναφορικά το σχηματισμό κενοτοπίων, τις εστιακές διαταραχές των μυοκαρδιακών ινών και τη διήθηση από μονοπύρηνα κυττάρα) και στις δύο επιλεχθείσες δόσεις. Επιπλέον, μείωσε κατά δοσο-εξαρτώμενο τρόπο τη μαλονιαλδιαλδεΰδη (MDA) και τα πρωτεϊνικά καρβονύλια (PCs), ενώ μείωσε και τα επίπεδα του mRNA της πρωτεΐνης MMP2 μόνο στην υψηλή δόση. Η χορήγηση υψηλής δόσης LEVO οδήγησε στη μείωση της εκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την επαγωγή οξειδωτικού στρες, καθώς παρατηρήθηκε μείωση των iNOS και NOX4. Στην ομάδα χορήγησης της υψηλής δόσης παρατηρήθηκε αύξηση της φωσφορυλίωσης των Akt, eNOS και AMPK. Στο υπο-χρόνιο πρωτόκολλο καρδιοτοξικότητας επαγόμενη από την DXR, η εφ’ άπαξ δόση της LEVO αύξησε τη συσταλτικότητα του μυοκαρδίου όπως φάνηκε από το κλάσμα συστολικής βράχυνσης (FS%) σε επίπεδα όμοια με την ομάδα ελέγχου και ανέστειλε τις μορφολογικές βλάβες που προκλήθηκαν από την DXR (αναφορικά το σχηματισμό κενοτοπίων και τη διήθηση από μονοπύρηνα κυττάρα). Η εφ’ άπαξ καθώς και η επανειλημμένη χορήγηση της LEVO παρουσίασαν την ίδια αντιοξειδωτική δράση επί του μυοκαρδίου όσον αφορά τη μείωση των MDA, PC, iNOS και NOX-4, καθώς επίσης οδήγησαν και σε αυξημένη έκφραση της MnSOD. Ωστόσο, μόνο η εφ’ άπαξ δόση της LEVO οδήγησε σε φωσφορυλίωση των Akt, eNOS και AMPK καθώς επίσης οδήγησε σε ενεργοποίηση των μονοπατιών cGMP-PKG και cAMP-PKA. Ως αποτέλεσμα, μόνο η εφ’ άπαξ δόση της LEVO οδήγησε στη φωσφορυλίωση της φωσφολαμβάνης (PLN). Αντίθετα, η εφ’ άπαξ δόση της LEVO, δεν παρουσίασε ευεργετικά αποτελέσματα σε διαγονιδιακούς μύες PLN-KO όσον αφορά την συσταλτικότητα του μυοκαρδίου, γεγονός που υποδηλώνει τον κεντρικό ρόλο της PLN στην καρδιοπροστασία που επάγεται από την LEVO. Τέλος, στο in vivo μοντέλο BC μυών, η LEVO ανέστειλε την μείωση της καρδιακής συσταλτικότητας που επάγεται από την χρόνια DXR-επαγόμενη καρδιομυοπάθεια καθώς επίσης οδήγησε σε αυξημένη επιβίωση των πειραματοζώων. Συμπεράσματα: Η εφ άπαξ χορήγηση LEVO προστατεύει από την καρδιομυοπάθεια που επάγεται από την DXR μέσω των οδών cGMP/cAMP/PLN, υπογραμμίζοντας το ρόλο της ινοτροπικής διέγερσης στην καρδιοτοξικότητα DXR και παρέχοντας τις προϋποθέσεις για περαιτέρω κλινικές δοκιμές της LEVO σε αυτή τη παθολογία.